簡介：2017版中科院中科院610分子生物學分子生物學全套考研資料全套考研資料我們是布丁考研網中科院考研團隊，是在讀學長。我們親身經歷過中科院考研，錄取后把自己當年考研時用過的資料重新整理，從本校的研招辦拿到了最新的真題，同時新添加很多高參考價值的內部復習資料，保證資料的真實性，希望能幫助大家成功考入中科院。此外，我們還提供學長一對一個性化輔導服務，適合二戰(zhàn)、在職、基礎或本科不好的同學，可在短時間內快速把握重點和考點。有任何考中科院相關的疑問，也可以咨詢我們，學長會提供免費的解答。更多信息，請關注布丁考研網。以下為本科目的資料清單（有實物圖及預覽，貨真價實）以下為本科目的資料清單（有實物圖及預覽，貨真價實）全套資料包括以下內容全套資料包括以下內容一、中科院一、中科院610610分子生物學考研內部信息匯總分子生物學考研內部信息匯總“備考篇”主要匯總了考中科院生物專業(yè)必備的一些信息，主要包括歷年復試分數線，本專業(yè)報考難度及競爭情況分析，根據歷年真題的考察范圍而歸納的考試大綱，學長對于政治、英語等公共課及本專業(yè)課的復習策略等。掌握初試必備的信息，才可安心復習。二、中科院二、中科院610610分子生物學歷年考研真題及答案解析分子生物學歷年考研真題及答案解析2016年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）（后續(xù)免費更新）2015年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2013年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2012年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2010年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2007年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2006年中科院610分子生物學考研真題（含答案解析）2002年中科院610分子生物學考研真題2001年中科院610分子生物學考研真題2000年中科院610分子生物學考研真題1999年中科院610分子生物學考研真題1998年中科院610分子生物學考研真題1997年中科院610分子生物學考研真題1996年中科院610分子生物學考研真題三、三、20172017版精品復習筆記（高分版）版精品復習筆記（高分版）教材的作用是學習知識點，但知識點分散性很大，而且無法區(qū)分重點、難點，不太適用于考試。為此，我們完全從考試的需求出發(fā)，對教材的章節(jié)重新進行了整理，將內容相關的章節(jié)合并，匯總為專題，并通過分析歷年真題提取出考點、重點和難點，將知識點與考研真題融為一體，形成這一套精品的復習筆記。通過本筆記，可在短時間內快速抓住重點和考點，提升成績顯著。本筆記主要包括以下幾個版塊1、知識概要、知識概要對本章內容所涵蓋的知識點進行最為簡單概括的總結，所有知識點一目了然。適用于初次復習本章節(jié)前知識點的快速了解，以及沖刺前的知識點回顧與檢驗。

簡介：分子生物學技術在中醫(yī)藥研究中的應用上海中醫(yī)藥大學方肇勤（2006/4/5）,,,,,,,理論課教室9201實驗課教室4111、4115,THANKS,

簡介：生物化學與分子生物學教學大綱生物化學與分子生物學教學大綱供五年制本科醫(yī)學生使用供五年制本科醫(yī)學生使用前言前言近年來，生物化學與分子生物學的發(fā)展突飛猛進，已成為醫(yī)學基礎學科中的先進領域，為其它多種學科發(fā)展的必不可少的核心。生物化學與分子生物學作為一個邊緣學科正向生物學、遺傳學、分子生理學、藥理學、病理學等學科領域滲透。為了更好地認識生命，研究生命，探索生命的奧秘，掌握生物化學與分子生物學，是非常必要的，尤其作為醫(yī)學生，要想在今后的醫(yī)學領域中施展才華，在分子水平上解決疾病的診斷，治療以及進行預防，學好生物化學與分子生物學這門課程就顯得更加重要。生物化學與分子生物學的研究內容已從五十年代的新陳代謝為中心轉移到分子生物學為重點。為了適應當今醫(yī)學基礎各學科及臨床醫(yī)學的需要，除了解與醫(yī)學有關的物質代謝，如糖代謝、脂代謝等能量代謝之外，更重要的是學好分子生物學的主要理論如核酸、蛋白等生物大分子的結構和功能，代謝調節(jié)機制及基因表達調控等，同時聯(lián)系臨床的常見疾病，重點在分子水平上認識其病因，加深對其治療原理的理解。本大綱正是從上述目的出發(fā)，在要求學生了解經典的物質代謝途徑的基礎上，使學生們著重聯(lián)系生命現(xiàn)象及臨床醫(yī)學進行學習，在對分子生物學的研究內容有充分認識的同時又可為從事臨床醫(yī)學打下深厚的基礎。生物化學與分子生物學是一門實驗科學，它的理論發(fā)展與各項技術的發(fā)明密切相關。因此，在生物化學與分子生物學教學中，實驗課占有很大比重，應予重視。生物化學與分子生物學理論課內容及學時分配生物化學與分子生物學理論課內容及學時分配章授課內容授課內容學時數學時數緒論1第一章蛋白質的結構與功能5第二章核酸的結構與功能4第三章酶6第四章糖代謝6第五章脂類代謝7第六章生物氧化4第七章氨基酸代謝6第八章核苷酸代謝4第十章DNA的生物合成（復制）6第十一章RNA的生物合成（轉錄）4第十二章蛋白質的生物合成（翻譯）4第十三章基因表達調控4第十四章基因重組與基因工程4第四節(jié)蛋白質的理化性質及其分離純化1蛋白質的理化性質兩性解離、膠體性質、蛋白質變性與復性、沉淀、紫外吸收和呈色反應。2蛋白質的分離和純化透析及超濾法，丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀，電泳，層析，超速離心。3多肽鏈中氨基酸的序列分析EDMAN降解法。4蛋白質空間結構測定【教學方法】課堂講授、多媒體【授課學時】5學時第二章核酸的結構與功能【目的要求】1掌握DNA的二級結構特點，MRNA和TRNA的結構特征及主要功能。2熟悉核小體的結構特點，DNA的理化性質及其與結構的關系。3了解核苷酸的分子構成，連接鍵及書寫方式。【教學內容】第一節(jié)核酸的化學組成及一級結構1核苷酸的結構嘌呤與嘧啶，核糖與核苷，戊糖碳原子的編號。2核酸的一級結構概念、核苷酸各組分間的連接鍵、書寫方式。第二節(jié)DNA的空間結構與功能1DNA的二級結構雙螺旋結構模型GAFF規(guī)則，BDNA雙螺旋結構模型要點，DNA雙螺旋結構的多樣性。2DNA的超螺旋結構及其在染色質中的組裝DNA的超螺旋結構，原核生物DNA的高級結構，DNA在真核生物細胞核內的組裝核小體。3DNA的功能基因，基因組，DNA的功能。第三節(jié)RNA的結構與功能1信使RNA的結構與功能HNRNA，MRNA的結構特點。2轉運RNA的結構與功能稀有堿基，莖環(huán)結構，氨基酸接納莖，反密碼子，三級結構。3核蛋白體RNA的結構與功能真核及原核生物核蛋白體的組成。4其他小分子RNA及RNA組學動物細胞內其他的RNA種類及功能，RNA組學的概念。第四節(jié)核酸的理化性質、變性和復性及其應用1核酸的一般理化性質260NM紫外吸收2DNA的變性概念，解鏈曲線，TM值，增色效應。3DNA的復性與分子雜交退火。第五節(jié)核酸酶

簡介：1一、填空題（每題一、填空題（每題2分，共分，共5050分）分）1果蠅具有豐富的外表型態(tài)差異，包括______、_____、_____，_______與______。2FISH技術的全稱是____________________________。3細菌轉導實驗中所用的菌株分別是____________和_____________用的培養(yǎng)基是__________培養(yǎng)基。4轉座子引起的插入突變實驗中所用的菌株分別是_________和_________。5在提基因組DNA時，為保證DNA的完整性應該采取的步驟有，，。6DNA凝膠電泳可以以和為凝膠介質，當DNA為＞BP時用作為介質，當DNA為＜BP時，用作為介質。7抽提DNA純化時，一般采用抽提，采用體積；沉淀DNA用，體積；洗滌沉淀時用。8DNA純度一般用比值來衡量，當比值在表示DNA很純，當表示不干凈，當表示含過多。9衡量DNA得率或濃度時應該用值來進行計算，公式表示為。10進行電泳加樣時，要將DNA樣品與混合，其主要成分為，如要加樣10LDNA要加L混合。11在提取DNA時，酚∕氯仿的作用是，其比例應為，可選擇使用酚︰氯仿︰異戊醇，酚的飽和是用，在使用酚時應注意，一般用的酚需要酚，要用瓶子來裝。12酚是蛋白變性劑，用酚抽提細胞DNA時，具有兩方面的作用12。13提質粒DNA時，加入STE的作用是；加入溶液Ⅰ的作用是，現(xiàn)象；加入溶液Ⅱ作用，現(xiàn)象，成分主要為，提供環(huán)境；加入溶液Ⅲ作用是，現(xiàn)象，成分主要是，目的是。14質粒DNA有以下狀態(tài)、、、，進行電泳時跑的最快在最前面，其次為、，最后為。15實驗過程中常用的槍頭有以下幾種L用色槍頭，L用色槍頭，L用__色槍頭。16轉化時用的感受態(tài)細菌需要用處理，轉化細菌時需要進行，時間為秒，目的是。17膠回收DNA時需注意，，應盡量將足夠小徹底，廈門大學廈門大學遺傳與分子生物學實驗遺傳與分子生物學實驗課程試卷課程試卷生命科學生命科學學院學院生物學生物學系2002年級年級各專業(yè)專業(yè)主考教主考教師章軍試卷類型（型（A卷B卷）卷）3參考答案參考答案一、填空題1眼色、眼形、翅形、剛毛的形狀和數目2熒光原位雜交技術3GAL、GAL、EMB4TN5、FD10065低溫、動作輕柔、抑制酶活6瓊脂糖、聚丙烯酰胺，100、瓊脂糖、100、聚丙烯酰胺7苯酚、一倍、無水乙醇、兩倍、70乙醇8OD260OD280、1820、〈18、DNA、〈16、蛋白質9OD、DNA濃度（ΜGML）（OD260OD330）50ΜGML稀釋倍數（100）10上樣緩沖液、溴酚蘭、111蛋白質變性、241、25241、TRIS、防止氧化、飽和、棕色12蛋白質變性、細胞破壁13緩沖液、溶菌、溶液渾濁、細胞破壁蛋白變性、溶液變粘稠、SDS、堿性、中和、絮狀沉淀、乙酸、使染色體和蛋白質變性沉淀，使質粒DNA析出14CCC、OC、LC、L、CCC、OC、LC、L151000、藍、200、黃、10、白16CACL2、42℃熱激、90、使質粒DNA轉化入細胞17去除雜質、提高得率、DNA膠切塊、溶解、膠塊、溶解液、13、70乙醇、無菌水18酚抽提、乙醇沉淀、加RNA酶1911、T4DNA連接酶20混勻、濃縮21中和DNA電荷促沉淀22變性、退火、延伸23溫度、MG、DNTP、模板、引物24降低反應溫度、縮短時間、減少用量2550二、簡答題26雌果蠅–個體較大–腹部末端較尖–腹部背面有五條黑條紋

簡介：1基因分子生物學期末復習題總結（選擇和填空各五十分）閉卷的話只背這些就夠了然后認真看出填空題的老師的課件一一CONTROLOFPROKARYOTICGENEEXPRESSION（原核原核）Ⅰ名詞名詞1OPERON操縱子，是基因表達調控的基本單位，包含結構基因、操縱基因等一些相鄰基因組成的DNA片段，其中操縱基因可被調節(jié)蛋白識別并調控，結構基因的表達又受到操縱基因的調控。2INDUCIBLEOPERON可誘導操縱子，當環(huán)境出現(xiàn)某一小分子時，與代謝相關的基因表達，即誘導物所誘導的操縱子為可誘導操縱子，如LAC操縱子，在誘導物作用下可產生本身代謝所需要的酶。3OPERAT操縱基因，是操縱子結構基因前的DNA區(qū)段，可以結合阻遏物或活化物。常位于基因啟動子的后面或與啟動子重疊，可控制臨近結構基因的表達。4COREPRESS輔阻遏物，阻遏蛋白與某一個小分子結合后活性被激活，阻止產生合成這種小分子相關的酶，那么這種小分子稱為，例如色氨酸。5REPRESSIBLEOPERON可阻遏操縱子，共阻遏物所抑制的操縱子為可阻遏操縱子，即共阻遏物的存在可以抑制結構基因所編碼酶的表達，如TRP操縱子等氨基酸合成相關的操縱子。6ATTENUAT衰減子，是ECOLITRP操縱子一段特殊的調控序列。位于上游啟動子與第一個結構基因之間，是TRP操縱子含有的一個特殊調節(jié)序列，色氨酸操縱子的前導序列有4個關鍵區(qū)，當大腸桿菌細胞中色氨酸水平較高，核糖體迅速的翻譯前導序列中的序列1，生成14肽，并在轉錄序列3之前占據序列2轉錄產物，以致前導序列轉錄產物序列3和序列4互補，形成類似終止子的衰減子結構。7ALARMONES信號素，原核生物應急反應中所產生的信號分子，PPGPPPPPGPP鳥苷45磷酸它們通過與靶蛋白的結合來改變其活性即刻產生調控作用，從而對代謝做出調節(jié)。8PROPHAGE原噬菌體，某些溫和噬菌體侵染細菌后，其DNA整合到宿主染色體上，處于整合狀態(tài)的噬菌體DNA為原噬菌體。它是繁殖和傳遞噬菌體本身遺傳信息的一種重要方式。9RIBOSWITCH核糖開關，是原核生物中一類調節(jié)RNA元件，它可以直接感受小分子的代謝來控制轉錄和翻譯，是不依賴調控蛋白的一種調節(jié)方式。10SRNAS細菌內小RNA，SRNAS是細菌內長80100NT的RNA調控序列。它們一般不由大的RNA前體形成，而是被自身基因所編碼產生。大多數的SRNA通過與靶MRNA配對來抑制轉錄，有些情況也促進轉錄。11ANTISENSERNAS反義RNA，由DNA鏈轉錄產生。一個RNA可以與某一個基因轉錄出的MRNA互補，那么這個RNA則稱為此MRNA的反義RNA，抑制MRNA的翻譯，主要在翻譯水平上調節(jié)基因表達的一種RNA（少數可調節(jié)其轉錄）。Ⅱ簡答簡答1簡述簡述LACOPERON的調控機制的調控機制。LAC操縱子由操縱基因O、結構基因Z、Y、A及調節(jié)基因組成。LAC操縱子在啟動子的35區(qū)缺乏UP元件，為弱啟動子。CAP和REPRESS分別通過影響RNAP與啟動子的結合來對LAC基因進行調控。是通過CAP蛋白的正調節(jié)和REPRESS的負調節(jié)這兩種調節(jié)來實現(xiàn)的3原核激活蛋白作用的主要機制有二1）通過募集RNA聚合酶激活轉錄，如LAC操縱子的激活蛋白；2）通過變構作用激活RNAPⅠ改變RNAP的構象使啟動子活化，如GLNA啟動子的NTRC激活蛋白；Ⅱ誘導啟動子DNA構象改變，如MERT啟動子的MERR激活蛋白。1）CAP募集作用，與RNAP協(xié)同來起始轉錄；2）NTRC與RNAP作用，利用NTRC的ATPASE的活性，水解ATP所釋放的能量來改變RNAP的構象，使得它從CLOSE狀態(tài)變?yōu)镺PEN；3）MERR改變啟動子區(qū)的DNA的構象，縮短DNA35區(qū)和10區(qū)之間的距離，并且使DNA發(fā)生旋轉，從而使35區(qū)和10區(qū)朝同一側。6舉例說明原核舉例說明原核REPRESSS的主要作用機制。的主要作用機制。原核阻遏蛋白的作用機制有二1）抑制RNAP跟啟動子的結合，由于阻遏蛋白結合位點與RNAP的結合位點有重疊區(qū)，因此RNAP被排斥，如LAZ操縱子中的LAC阻遏蛋白；2）阻遏蛋白結合到非啟動子位點，與RNAP相互作用，從而抑制轉錄起始，如ECOLI的GAL阻遏蛋白。8簡述簡述TRPOPERON的調控機制的調控機制。TRP操縱子（TYPOPERON）負責TRP的生物合成，包括啟動子，操縱基因及5個結構基因。在第一個結構基因的上游有一段簽到序列，其轉錄產物可以分為4個區(qū)域，通過配對調控基因表達。當培養(yǎng)基中有足夠的TRP時，這個操縱子自動關閉，缺乏TRP時操縱子被打開，TRP基因表達，TRP或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程中起作用。TRP操縱子的調控機制主要有兩種1）阻遏作用TRP操縱子轉錄起始的調控是通過TRP阻遏蛋白實現(xiàn)的。在色氨酸的存在下，它結合到TRP抑制子上，誘導該蛋白構象改變，可結合于操縱基因，抑制結構基因的表達。但該負調控的能力相對較低，此過程中色氨酸為輔阻遏物。2）衰減作用TRP操縱子轉錄終止的調控是通過衰減作用實現(xiàn)的。原核生物轉錄翻譯偶聯(lián)，當轉錄開始后一段時間，若ECOLI中TRP水平較高，核糖體迅速地翻譯出前導序列中的序列1，生成14肽，并占據序列2區(qū)域，使前導序列轉錄產物3和4互補，形成類似終止子的衰減子結構；如果TRP水平較低，核糖體在序列1處翻譯出9肽產物，使得序列2和3互補，阻止了衰減子的形成，使轉錄繼續(xù)進行。通過TRP的濃度在轉錄、翻譯2個層次調節(jié)基因表達。9細菌營養(yǎng)環(huán)境極差（如缺乏氨基酸）時如何進行應急反應細菌營養(yǎng)環(huán)境極差（如缺乏氨基酸）時如何進行應急反應在缺乏氨基酸的環(huán)境下，細菌會停止大部分活動，應急反應會使RNA水平降低510，使兩種信號素PPGPP及PPPGPP聚集，它們通過與靶蛋白的結合來改變其活性。未負載的TRNA與A位點結合，觸發(fā)應急反應，RELA被活化，合成（P）PPGPP，它們降低了某些基因如RDNA的轉錄或者是增加另一些基因的轉錄，部分是因為改變了與RNAP的結合及改變RNAP啟動子的特異性。10細菌如何利用細菌如何利用RIBOSWITCH調控基因表達調控基因表達核糖開關常包含兩個結構域適體結構域AD及表達結構域EPD。調控機制核糖開關的適體結構域與小分子結合，傳達到表達結構域，進而在轉錄或翻譯水平調控基因的表達。該調控主要通過改變RNA的二級結構來完成的。概括地說，存在兩種機制核糖開關的作用域由序列14四部分組成

簡介：478華南理工大學2006年攻讀碩士學位研究生入學考試試卷（試卷上做答無效，請在答題紙上做答，試后本卷必須與答題紙一同交回）科目名稱生物化學與分子生物學適用專業(yè)微生物學生物化學與分子生物學共頁第1頁一選擇題（從備選答案中選出一個正確的答案，把答案代碼填在答題紙上，每選擇題（從備選答案中選出一個正確的答案，把答案代碼填在答題紙上，每小題小題1分，共分，共2020分）（１）下列有關真核生物肽鏈合成啟動的論述何者是正確的CA只需ATP提供能量B只需GTP提供能量C同時需要ATP和GTP提供能量D40S亞基與MRNA結合E50S亞基與39S亞基結合（２）在PH10的谷氨酸溶液中，下列哪一種結構占優(yōu)勢EA羧基氨基都解離B羧基氨基都不解離C只Α羧基解離D只Γ羧基解離EΑ羧基與Γ羧基都解離（３）單鏈DNA分子5’PCPGPGPTPA3’能夠與下列哪一種RNA單鏈分子進行雜交Ａ5’PGPCPCPTPA3’B5’PGPCPCPAPU3’C5’PUPAPCPCPG3’D5’PTPAPGPGPC3’E5’PTPUPCPCPG3’（４）下列關于還原型谷胱甘肽結構與性質的敘述哪一種是錯誤的EA含有兩個肽鍵B“胱”代表半胱氨酸C谷氨酸的ΓCOOH參與了肽鍵的形成D含有一個巰基E變成氧化型谷胱甘肽時脫去的兩個氫原子是由同一個還原型谷胱甘肽分子所提供的第3頁10蛋白質三維結構的構象特征主要取決于BA氨基酸的組成、順序和數目B氫鍵、鹽鍵、范德瓦爾斯力和疏水力等構象維系力C溫度、PH和離子強度等環(huán)境條件D肽鏈間及肽鏈內的二硫鍵E各氨基酸間彼此借以相連的肽鍵11蛋白質變性是由于AA氫鍵被破壞B肽鍵斷裂C蛋白質降解D水化層被破壞及電荷被中和E亞基的解聚12A型DNA和B型DNA產生差別的原因是DAA型DNA是雙鏈，B型DNA是單鏈BA型DNA是右旋，B型DNA是左旋CA型DNA與B型DNA堿基組成不同D兩者的結晶狀態(tài)不同E兩者堿基平面傾斜角度不同13TRNA在發(fā)揮其功能時的兩個重要部位是EA反密碼子臂和反密碼子環(huán)B氨基酸臂和D環(huán)CTΨC環(huán)與可變環(huán)DTΨC環(huán)與反密碼子環(huán)E氨基酸臂和反密碼子環(huán)14將米氏方程改為雙倒數方程后BA1V與1S成反比B以1V對1S作圖，其橫軸為1SCV與S成正比DKM在縱軸上EVMAX值在縱軸上15脂肪酸Β氧化的限速酶是AA肉堿脂酰轉移酶IB肉堿脂酰轉移酶IIC脂酰COA脫氫酶

簡介：一陳瑞川（1）GENETRANSFERTOGETSTABLECELLLINEATRANSIENT（短暫的）TRANSFECTION1LIPOSOME（脂質體）MEDIATEDGENETRANSFERLIPOFECTAMINE（脂質體）TRANSFECTION2CA2CA2CA33POPOPO4422––MEDIATEDMEDIATEDMEDIATEDGENEGENEGENETRANSFERTRANSFERTRANSFER3PEI3PEI3PEI（（聚乙二胺））MEDIATEDMEDIATEDMEDIATEDGENEGENEGENETRANSFERTRANSFERTRANSFER444ELECTROPATIONELECTROPATIONELECTROPATION（（電穿孔））BSTABLETRANSFECTION1ADENOVIRUSINFECTION（腺病毒感染）2RETROVIRUSINFECTION（反轉錄病毒載體法）3LENTIVIRUSINFECTION（慢病毒載體轉染法）4COTRANSFECTION（2）HOWTOGETSTABLECELLLINE1INFECTIONCOTRANSFECTION2ANTIBIOTICSION3COLONIESGROWTH4EXPRESSIONDETECTION5CELLLINESTAGE（（33））HOMOLOGYHOMOLOGYHOMOLOGYSEARCHSEARCHSEARCHOFOFOFEXISTINGEXISTINGEXISTINGCDNACDNACDNADATADATADATABASESBASESBASESGENBANKGENBANKGENBANKBLASTBLASTBLASTNCBINCBINCBIBLASTBLASTBLASTHOMEHOMEHOMEPAGEWWWNCBINLMNIHGOVBLASTPAGEWWWNCBINLMNIHGOVBLASTPAGEWWWNCBINLMNIHGOVBLASTGOGOGOTOTOTOPROTEINPROTEINPROTEINBLASTBLASTBLASTPAGEPAGEPAGEPASTEPASTEPASTEYOURYOURYOURPROTEINPROTEINPROTEINSEQUENCESEQUENCESEQUENCEENTERENTERENTERACCESSIONACCESSIONACCESSIONNUMBERNUMBERNUMBEROFOFOFYOURYOURYOURPROTEINPROTEINPROTEININTOINTOINTOTHETHETHEBOXBOXBOXUSUALLYUSUALLYUSUALLYPROTEINPROTEINPROTEINPROTEINPROTEINPROTEINBLASTBLASTBLASTAK056946AK056946AK056946HOMOHOMOHOMOSAPIENSSAPIENSSAPIENSCDNACDNACDNAFLJ32384FLJ32384FLJ32384FISFISFISCLONECLONECLONESKMUS1000104SKMUS1000104SKMUS1000104WEAKLYWEAKLYWEAKLYSIMILARSIMILARSIMILARTOTOTOHOMOHOMOHOMOSAPIENSSAPIENSSAPIENSMRNAMRNAMRNAFFFHEXIM1HEXIM1HEXIM1PROTEINCOMPLETEPROTEINCOMPLETEPROTEINCOMPLETECDSCDSCDS二二二二俞春東俞春東俞春東俞春東（（11））什么是近交系小鼠它們有什么特性有哪些常用的近交系小鼠什么是近交系小鼠它們有什么特性有哪些常用的近交系小鼠什么是近交系小鼠它們有什么特性有哪些常用的近交系小鼠答答答近交系小鼠近交系小鼠近交系小鼠近交系小鼠是經連續(xù)是經連續(xù)是經連續(xù)202020代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第202020代或以后代或以后代或以后代數的一對共同祖先。代數的一對共同祖先。代數的一對共同祖先。特性特性特性特性111基因位點的純合性（基因位點的純合性（基因位點的純合性（HOMOZYGOSITYHOMOZYGOSITYHOMOZYGOSITY））近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達999999％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖毛色毛色毛色AGOUTIAGOUTIAGOUTI棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）應用1980年代，具穩(wěn)定性的小鼠胚胎干細胞株皆源自129SV純系小鼠。1990年代，基因定位GENETARGETING試驗結果證實其為極成功的動物模型。444FVBFVBFVB系系毛色白化毛色白化毛色白化起源起源起源源自遠交系源自遠交系源自遠交系SWISSSWISSSWISS鼠。鼠。鼠。193519351935年，在年，在年，在NIHNIHNIH飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，196619661966年起開始選育，在年起開始選育，在年起開始選育，在接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系HSFSNHSFSNHSFSN對組胺對組胺對組胺HISTAMINEHISTAMINEHISTAMINE敏感。敏感。敏感。707070年代年代年代初，在初，在初，在HSFSNHSFSNHSFSN系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶FV1FV1FV1BB基因對基因對基因對BBSTRAINSTRAINSTRAINFRIENDFRIENDFRIEND白白血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成FV1FV1FV1BB同型合子近交系，稱同型合子近交系，稱同型合子近交系，稱FVBFVBFVB。。NIHNIHNIH、、JACKSONJACKSONJACKSON等保等保等保存。存。存。應用應用應用FVBFVBFVB通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射DNADNADNA。。333我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系1946年，我國從印度HAGGKINE研究所引入小鼠，這是當今廣泛應用的昆明種小鼠昆明種小鼠的原種。應用優(yōu)點應用優(yōu)點應用優(yōu)點應用優(yōu)點（（11）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物就可得到非常規(guī)律的實驗結果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實驗結果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實驗結果。（（22）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植實驗中最為理想的材料。實驗中最為理想的材料。實驗中最為理想的材料。（（33）明顯的生物學特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。（（44）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影響，還可觀察實驗結果是否具有普遍意義。響，還可觀察實驗結果是否具有普遍意義。響，還可觀察實驗結果是否具有普遍意義。190919091909年，年，年，CCCCCCLITTLELITTLELITTLE首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了DBADBADBA近交系小鼠，成為實驗動物近交系小鼠，成為實驗動物近交系小鼠，成為實驗動物發(fā)展史上發(fā)展史上發(fā)展史上第一個近交系動物。第一個近交系動物。第一個近交系動物。第一個近交系動物。（（22））設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。基因敲除（基因敲除（基因敲除（基因敲除（KNOCKOUTKNOCKOUTKNOCKOUT））是是202020世紀世紀世紀808080年代后半期應用年代后半期應用年代后半期應用DNADNADNA同源重組原理發(fā)展起來同源重組原理發(fā)展起來同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。測相應基因的功能。測相應基因的功能。目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為129SV129SV129SV）的）的）的ESESES細胞細胞細胞主要是因為主要是因為主要是因為ESESES細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中的多潛能細胞建立的，在體細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中的多潛能細胞建立的，在體細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中的多潛能細胞建立的，在體外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（LIFLIFLIF）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外ESESES細胞有細胞有細胞有利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。步驟步驟1構建打靶載體（含有一段與欲敲除的基因具有高度同源性外源基因并插入一帶有啟動子的選擇標記基因）2含有修飾后外源基因的載體利用轉染的方法，如磷酸鈣共沉淀、電轉移和逆轉錄病毒介導等方法導入ES細胞中3外源基因與染色體上的靶基因發(fā)生同源重組，把修飾的外源基因置換到ES細胞，通過篩選標記基因而檢出發(fā)生同源重組的ES細胞并在體外擴增4此ES細胞注入供體囊胚再將帶有此ES細胞的囊胚胎移植到假孕鼠的子宮內，發(fā)育成一個嵌合體5經過進一步雜交傳代的方法，使外源基因純合，即建立成基因敲除動物模型

簡介：第一章第一章緒論緒論要點難點要點難點1必須掌握分子生物學的基本概念；2一般了解分子生物學發(fā)展簡史，特別是那些與分子生物學發(fā)展有密切關系的關鍵事件；3熟悉分子生物學的研究內容和它的一些分支學科；4探討分子生物學的發(fā)展趨勢。主要內容主要內容（一）分子生物學的基本概念1分子生物學術語2分子生物學的任務（二）分子生物學誕生的背景及發(fā)展簡史發(fā)展史表1早期的分子生物學發(fā)展動態(tài)2現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展（三）分子生物學的研究內容1DNA重組技術2基因表達調控3結構分子生物學4基因組5功能基因組6生物信息學（四）分子生物學發(fā)展前景展望、它與其它學科的關系習題習題一、名詞解釋一、名詞解釋1分子生物學（MOLECULARBIOLOGY）2DNA重組技術（RECOMBINANTDNATECHNIQUES）3基因（GENE）二、填空題二、填空題1分子生物學是研究核酸等生物大分子的、、及其重要性和規(guī)律性的科學，是人類從水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。2分子生物學主要研究核酸在細胞生命過程中的作用，包括的復制、以及基因的規(guī)律，所以，這門學科其實應該叫做核酸生物學（BIOLOGYOFNUCLEICACID）。31869年米歇爾（FRIEDRICHMIESCHER）分離出。4有位科學家首先發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶，打破了中心法則，該酶能使MRNA反轉錄成CDNA，使真核基因的克隆表達成為可能，為病毒學、遺傳學、基因工程作出了重大貢獻，他們獲得1965年諾貝爾獎。這位科學家是（）（A）JACQUESMONOD（B）DBALTIME（C）HTEMIN（D）MARSHALLNIRENBERG（E）ROBERTHOLLEY51973年發(fā)展了重組DNA技術，發(fā)現(xiàn)改造后的DNA分子可在外來細胞中復制。這位科學家是（）（A）HERBERTBOYER（B）STANLEYCOHEN（C）HTEMIN（D）MARSHALLNIRENBERG（E）ROBERTHOLLEY四、簡答題四、簡答題1分子生物學的研究內容有哪些2證明DNA是遺傳物質的兩個關鍵性實驗是肺炎雙球菌在小鼠體內的毒性和T2噬菌體感染大腸桿菌，簡單闡述從這兩個實驗中所得出的主要的論點。3DNA重組技術有何應用前景4基因表達調控主要發(fā)生在什么水平上5基因表達調控研究主要有哪些內容6結構分子生物學的研究內容是什么7人類基因組計劃的意義8什么是人類蛋白質組計劃答案部分答案部分第一章第一章緒論一、名詞解釋一、名詞解釋1分子生物學（MOLECULARBIOLOGY）答分子生物學是從分子水平上研究生命本質的一門新興邊緣學科，廣義的講，一切從分子水平研究生命奧秘的研究工作都是分子生物學。它是研究核酸等生物大分子的形態(tài)、結構、功能、及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當前生命科學中發(fā)展最快并正在與其它學科廣泛交叉與滲透的重要前沿領域。2DNA重組技術（RECOMBINANTDNATECHNIQUES）答DNA重組技術（又稱基因工程），它是將不同的DNA片段（某個基因或基因的一部分）按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。嚴格地說，DNA重組技術并不完全等于基因工程，因為后者還包括其他可能使生物細胞基因組結構得到改進的體系。3基因（GENE）

簡介：分子生物學分子生物學名詞解釋名詞解釋作者作者上海醫(yī)學院上海醫(yī)學院2011級臨八臨八戴春峰戴春峰絕密絕密117僅供學習交流，切勿用于商業(yè)用途，否則后果自負（一）核酸的結構與功能（一）核酸的結構與功能1核苷（NUCLEOSIDE）由戊糖和堿基通過ΒN糖苷鍵連接形成的化合物。2核苷酸（NUCLEOTIDE）是核酸的基本組成單位，由堿基、戊糖和磷酸連接而成。分為核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩類。3稀有堿基（RAREBASE）是指核酸分子中除常見的A、G、C、U、T堿基外，還含有的其它微量堿基。大多數是甲基化修飾堿基。TRNA中稀有堿基的含量較多，如DHU、Ψ。4多聚核苷酸（POLYNUCLEOTIDE）多個核苷酸通過35磷酸二酯鍵連接而成的鏈狀聚合物。5DNA的一級結構（PRIMARYSTRUCTUREOFDNA）是指在多聚核苷酸鏈中，5’→3’方向的脫氧核苷酸的排列順序。由于核苷酸之間的差異主要是堿基的不同，所以DNA的一級結構也稱為堿基序列。6DNA雙螺旋結構（DOUBLESPIRALSTRUCTUREOFDNA）是由沃森和克里克于1953年提出的DNA二級結構模型。要點有由2條反向平行的多聚核苷酸鏈共同圍繞中心軸盤旋而成雙螺旋結構；由脫氧核糖和磷酸基團構成的親水性骨架位于雙螺旋結構的外側，而疏水的堿基位于內側；堿基之間的氫鍵和堿基堆積力共同維系雙螺旋結構的穩(wěn)定性。7堿基互補配對（COMPLEMENTARYBASEPAIRING）核酸分子中，堿基之間有固定的配對方式，即A始終與T配對，形成2個氫鍵；G始終與C配對，形成3個氫鍵。8堿基堆積力（BASESTACKINGINTERACTION）相鄰的兩個堿基對平面在旋進過程中發(fā)生相互重疊，由此產生了疏水性的堿基堆積力。這種堿基堆積力和互補堿基對的氫鍵共同維系著DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定，并且堿基堆積力在雙螺旋結構的穩(wěn)定中起著更為重要的作用。9HOOGSTEEN氫鍵配對（HOOGSTEENHYDROGENBONDPAIRING）在酸性溶液中，胞嘧啶的N3由于質子化，故可以和鳥嘌呤的N7原子形成附加氫鍵；同時胞嘧啶的N4的氫原子也可以和鳥嘌呤的O6形成氫鍵。HOOGSTEEN氫鍵的形成并不破壞原有配對，而是形成了一種三鏈結構（常在DNA雙螺旋的局部出現(xiàn)）。10DNA的三級結構（TERTIARYSTRUCTUREOFDNA）DNA在雙螺旋結構基礎上通過盤繞和折疊所形成的空間構象稱為三級結構。在原核生物中，常以超螺旋結構出現(xiàn)；在真核生物中，則多為核小體結構。11超螺旋（SUPERHELIXSUPERCOIL）將DNA的兩端固定，使之旋進過分或旋進不足，DNA雙鏈上就會發(fā)生扭曲，以抵消張力。這種扭曲稱為DNA雙鏈的超螺旋結構。若旋進過分的方向和DNA雙鏈的螺旋方向相同，則稱為正超螺旋；反之，則稱為負超螺旋。12核小體（NUCLEOSOME）是真核生物染色質的基本結構單位，由DNA和組蛋白構成。各兩分子的H2A、H2B、H3和H4組成八聚體組蛋白核心，DNA鏈以左手螺旋方式在上面纏繞175圈形成核心顆粒。相鄰核心顆粒間由H1組蛋白和一小段DNA連接組成核小體。各個核小體可沿分子生物學分子生物學名詞解釋名詞解釋作者作者上海醫(yī)學院上海醫(yī)學院2011級臨八臨八戴春峰戴春峰絕密絕密317僅供學習交流，切勿用于商業(yè)用途，否則后果自負將不同來源的DNA混合在一起，經熱變性后，讓其緩慢冷卻復性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域具有互補序列，復性時就會形成雜化雙鏈。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA單鏈之間形成，也可在RNA單鏈之間形成，甚至還可以在DNA單鏈和RNA單鏈之間形成，其前提條件是兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。SOUTHERN印跡、NTHERN印跡等都應用了這一原理。（二）核苷酸（二）核苷酸的代謝的代謝1核苷酸的從頭合成途徑（DENOVOSYNTHESISPATHWAY）是利用簡單的前體物質（如磷酸核糖、氨基酸、一碳單位、CO2）為原料，經過一系列的酶促反應，合成核苷酸的過程。2核苷酸的補救合成途徑（SALVAGESYNTHESISPATHWAY）是利用體內游離的堿基或核苷（脫氧核苷），經過簡單的反應步驟，合成核苷酸的過程。與從頭合成相比，較為簡單，且節(jié)省能耗；一些中樞神經系統(tǒng)器官只能以此方式合成核苷酸。3磷酸核糖焦磷酸（PHOSPHIBOSYLPYROPHOSPHATEPRPP）是由5’磷酸核糖在PRPP合成酶的作用下，從ATP中獲得焦磷酸而形成，是磷酸核糖的活性供體。PRPP是嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸從頭合成過程中的重要中間產物，也參與嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的補救合成過程。4痛風（GOUT）是一種嘌呤代謝障礙性疾病，其基本生化特征是高尿酸血癥。當血尿酸濃度超過048MMOLL時，尿酸鹽結晶就會沉積于軟骨關節(jié)處，形成痛風性關節(jié)炎；或在腎臟中沉積成腎結石。臨床上常用別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而治療痛風。5核苷酸的抗代謝物（ANTIMETABOLITE）是一些堿基、氨基酸、葉酸的類似物。它們以競爭性抑制或以假亂真的方式，干擾、阻斷核苷酸的正常合成代謝過程，從而進一步阻止核酸、蛋白質的生物合成以及細胞的增殖。臨床上常用于治療腫瘤；但對增殖速度較旺盛的某些正常組織也有殺傷性，存在較大的毒副作用。（三）（三）DNA的生物合成的生物合成1中心法則（CENTRALDOGMA）遺傳信息從DNA傳向RNA，再由RNA傳向蛋白質。這種遺傳信息的傳遞規(guī)律稱為中心法則。2復制起始點（IGINOFREPLICATIONI）是指DNA復制所必需的、可以控制其合成的一段特殊DNA序列。原核生物只有一個復制起始點；真核生物則有多個。不同生物的復制起始點序列不盡相同，但均含有短的重復序列，可被相關蛋白識別和結合。3復制叉（REPLICATIONFK）雙螺旋DNA復制時，復制區(qū)生長點的結構呈Y形或叉形，稱之為復制叉。在大多數的生物中，一個復制泡上的兩個復制叉可以分別向相反的方向進行DNA復制（雙向復制）。4復制子（REPLICON）是指從一個DNA復制起始點開始的一段DNA復制區(qū)域。它是一個獨立的復制單位，包括復制起始點和終點。5半保留復制（SEMICONSERVATIVEREPLICATION）DNA復制時，母鏈DNA解開成兩股單鏈，各自作為模板合成兩個子代DNA。這樣一

簡介：分子生物學基本技術在腫瘤研究中的應用分子生物學基本技術在腫瘤研究中的應用DNA重組技術（或基因工程）是20世紀生物學的偉大成就，并已滲透到生命科學包括醫(yī)學各個領域，為腫瘤的實驗研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術和有用的工具。本附錄扼要介紹在分子腫瘤學領域中常用的分子生物學基本技術及其在腫瘤研究中的應用，著重介紹它們的原理和應用。至于具體的技術方法和操作步驟可參閱分子克隆實驗指南（第二版，科學出版社，1992年）等實驗指導。一、常用的分子生物學基本技術核酸分子雜交技術由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（PROBE）待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為CDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（SOLIDPHASEHYBRIDIZATION）是將變性的DNA固定于固體基質（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。斑步雜交（DOTHYBRIDIZATION）是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據斑點雜并的結果，可以推算出雜交陽性的拷貝數。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。印跡雜交（BLOTTINGHYBRIDIZATION）SOUTHERN印跡雜交凝膠電離經限制性內切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經干烤固定，再與相對應結構的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量?？蛇M行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。NTHERN印跡雜交由SOUTHERM印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定MRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。該法的優(yōu)點是特異性高，可精確定位；能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)。因此被廣泛應用于醫(yī)學生物學的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。DNA分子克隆技術（也稱基因克隆技術）在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆或基因克隆。其基本步驟包括制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（VECS）在細胞內自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結構與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（GENOMICLIBRARY）另一種是CDNA庫。載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。細菌質粒是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結構的DNA，分子大小為120KB，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質粒載體是在天然質粒的基礎上人工改造拼接而成。最常用的質粒是PBR322。噬菌體（PHAEG）噬菌體是感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型Λ噬菌體改造和構建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50KB，最常用的嘵菌體為ΛDNA及其衍生系列。黏性質粒（COS）是由質粒與噬菌體ΛDNA組成的一種46KB的環(huán)狀雜種DNA。表達型載體將上述細菌質粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體?；驇斓慕ㄔ旌心撤N生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經過純化和擴增，可用于進一步的研。其主步驟包括（1）構建基因庫迅速的載體；2DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。CDNA庫的建造是指克隆的DNA片段，是由逆轉錄酶自MRNA制備的CDNA。CDNA庫包括某特定細胞的全部CDNA克隆的文庫，不含內含子。特異基因的篩選

簡介：博士學位論文博士學位論文SHANGHAIUNIVERSITYDOCTALDISSERTATION題目數據挖掘方法用于參與代謝的小分數據挖掘方法用于參與代謝的小分子生物學功能預測研究子生物學功能預測研究作者學科專業(yè)學科專業(yè)材料學材料學導師完成日期完成日期二零一二年五月二零一二年五月上海大學博士學位論文2012年5月II原創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是本人在導師指導下進行的研究工作。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫過的研究成果。參與同一工作的其他同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽名日期本論文使用授權說明本論文使用授權說明本人完全了解上海大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即學校有權保留論文及送交論文復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热荨＃ūＣ艿恼撐脑诮饷芎髴袷卮艘?guī)定保密的論文在解密后應遵守此規(guī)定）簽名導師簽名日期

簡介：一、DNA復制,DNA的半保留復制DNA復制的主要方式原核生物和真核生物DNA復制的特點DNA復制的調控DNA的修復1,自學,DNA的轉座,“倘若你認為自己邁開的步伐是正確的，并且已經掌握了專門的知識，那么，任何人都阻撓不了你，不必去理會人們的非難和評頭品足?！盉ARBARAMCCLINTOCK,“如果你能腳踏實地從事研究并如實報告觀察結果，同時保持健康長壽，那么，你有可能獲諾貝爾獎?！盉ARBARAMCCLINTOCK,1983年諾貝爾生理醫(yī)學獎,,DNA的轉座DNA的移位TRANSPOSITION,是由可移位因子（TRANSPOSABLEELEMENT）介導的遺傳物質重排現(xiàn)象。,,轉座子（TRANSPOSON,TN）是存在于染色體DNA上可自主復制和移位的基本單位。,在轉座過程中，有的轉座子會留在原來位置上，在新位點上出現(xiàn)的僅僅是它的拷貝。,在生物體內普遍存在,“轉座”就是轉座子的移位嗎,轉座子的分類,插入序列（INSERTIONALSEQUENCE,IS因子）,復合型轉座子（COMPOSITETRANSPOSON）,最簡單的轉座子，不含任何宿主基因，是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。,帶IS序列,不帶IS序列,帶有某些抗藥性基因（或其它宿主基因）的轉座子，兩翼往往是相同或高度同源的IS序列。,,,TNA家族不帶IS序列體積龐大（5KB）的轉座子，帶有Β－內酰胺酶（AMPR）基因和兩個轉座必需基因。,末端常帶有倒置重復序列,復制型轉座子,轉座子的分類續(xù),非復制型轉座子,在復制過程中,整個轉座子被復制,所移動的是原轉座子的拷貝,轉座酶TRANSPOSASE和解離酶RESOLVASE分別作用于原始轉座子和復制轉座子,如TNA類轉座子。,在復制過程中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接被移位，如IS序列、MU、TN5等。,DNA轉座的遺傳學效應,1、引起插入突變各種IS、TN轉座子都可以引起插入突變。2、產生新基因3、產生染色體畸變4、引起生物進化,二、從DNA到RNA,RNA轉錄的基本過程,RNA鏈合成特點RNA是按方向合成，在催化下，以DNA鏈中的鏈為模板，以為原料，根據堿基配對原則，各核苷酸間通過磷酸二酯鍵相連，（需要/不需要）引物的參與，合成的RNA帶有與DNA編碼鏈（有意義鏈）相同的序列（AU）。,模板識別,轉錄起始,轉錄延伸,轉錄終止,,,,5’→3’,反義,RNA聚合酶,4種核苷三磷酸,TA、,,AU、,GC,模板識別（TEMPLATERECOGNITION）指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結合的過程。,PROMOTER是基因轉錄起始所必需的一段DNA序列，是基因表達調控的上游順式作用元件之一。,直接識別并結合,轉錄調控因子,RNA聚合酶,,,轉錄起始前復合物（PREINTIATIONTRANSCRIPTIONCOMPLEX,PIC）,,,開放復合物在RNA轉錄的模板識別階段，隨著DNA結構變化，聚合酶與啟動子形成的封閉復合物轉變成開放復合物，此時DNA序列中有一小段雙鏈被解開。,封閉復合物在RNA轉錄的模板識別階段，聚合酶與啟動子可逆性結合形成的復合物，此時DNA處于雙鏈狀態(tài)。,三元復合物在RNA轉錄的模板識別階段，開放復合物與最初的2個NTP相結合并在它們之間形成磷酸二酯鍵后即轉變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的復合物。,強啟動子快速/不可逆封閉復合物開放復合物,,,,,模板識別,,轉錄起始前復合物,PIC,轉錄起始（INITIATION）,不需要引物,,RNA聚合酶合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉錄進入延伸階段。RNA聚合酶通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。,轉錄延伸（ELONGATION）RNA聚合酶釋放Σ因子離開啟動子后，核心酶沿模板DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。,ECOLIRNA聚合酶5090個核苷酸/秒,轉錄終止（TERMINATION）當RNA鏈延伸到轉錄終止時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNADNA雜合物分離，轉錄泡瓦解，DNA恢復雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來。,RNA聚合酶,原核生物,ECOLIRNA聚合酶,2個Α亞基,1個Β亞基,1個Β’亞基,1個Ω亞基,1個Σ亞基,,,負責模板鏈的選擇和轉錄起始，使酶專一性識別模板上的啟動子。存在多個Σ因子，用以識別不同的啟動子。,全酶（HOLOENZYME）,,,催化核心,,核心酶,,,,與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物結合。,可能與核心酶組裝及啟動子識別有關，并參與RNA聚合酶和部分調節(jié)因子的相互作用。,,一種RNA聚合酶幾乎合成所有RNA,真核生物,RNA聚合酶I,RNA聚合酶II,RNA聚合酶III,轉錄產物,RRNA,HNRNA,TRNA、5SRRNA、SNRNA,,,,,MRNA,一般由816個亞基組成,Α鵝膏覃堿,,低濃度動植物中，RNA聚合酶II被抑制，RNA聚合酶I沒影響，RNA聚合酶III在各生物中差異大。,高濃度動物細胞中抑制轉錄，但昆蟲中無影響。,啟動子的結構,轉錄單元（TRANSCRIPTIONUNIT）是一段從啟動子開始至終止子結束的DNA序列。,你還記得什么是啟動子嗎,,,,RNA,,,轉錄起始位點,在RNA聚合酶與DNA結合的區(qū)域內有一個由6個核苷酸組成的序列，是RNA聚合酶的緊密結合點，該位點的中央約位于起點上游10BP處，又稱10區(qū)。,PRIBNOW區(qū)（PRIBNOWBOX）,,,在PRIBNOWBOX外存在的與RNA聚合酶對啟動子識別有關的共同序列TTGACA，它位于起點上游35BP處。,35區(qū),原核生物啟動子的特點,10區(qū)和35區(qū)是RNA聚合酶與啟動子的結合位點，能與Σ因子相互識別，具有很高的親和力。,真核生物啟動子的特點,HOGNESS區(qū)（HOGNESSBOX）,在真核生物中，位于轉錄起始點上游3025BP處存在共同序列TATAAA，也稱TATA區(qū)。,CAAT區(qū)（CAATBOX）,在真核生物中，位于轉錄起始點上游7870BP處存在一段共同序列CCAAT，它與原核生物中35區(qū)相對應。,GC區(qū)、增強子區(qū),將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）,,原核與真核生物MRNA的特征比較,原核生物的MRNA,1、半衰期短2、可能以多順反子形式存在3、5’端無帽子結構，3’端沒有或只有較短的POLYA結構,單順反子MRNA只編碼一個蛋白質的MRNA。,多順反子MRNA編碼多個蛋白質的MRNA。,,真核生物的MRNA,1、5’端有“帽子”結構2、3’端有POLYA“尾巴”結構,帽子結構是GTP和原MRNA5’三磷酸腺苷（或鳥苷）縮合反應的產物。,常被甲基化,組蛋白基因,轉錄后,真核基因轉錄終止位點上游1530BP處的保守序列AAUAAA,RNA聚合酶II至尾巴下游052KB核苷酸處,,“帽子”是什么所有真核MRNA都有“尾巴”嗎“尾巴”是何時產生的什么是加尾和初級轉錄產物準確切割所必需的RNA聚合酶都在“尾巴”終止嗎,真核生物初始轉錄產物的加工,DNA轉錄生成的原始轉錄產物即MRNA的前體，經過和，再經過，編碼蛋白質的外顯子部分就連接成為一個連續(xù)的，通過核孔進入細胞質，即可作為蛋白質合成的模板了。,核不均一RNA（HNRNA）,5’加帽,3’加多聚腺苷酸,RNA的剪接,開放閱讀框（ORF,核酶RIBOZYME,是一類具有催化功能的RNA分子,通過催化靶位點RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂,特異性剪切底物RNA分子,從而阻斷基因的表達。,,RIBONUCLEICACID,ENZYME,酶不僅是蛋白質T4RNA、一些植物類病毒和擬病毒也可自我剪接是繼反轉錄之后對中心法則的又一重要修正，說明RNA既是又是。,核酶,遺傳物質,酶,三、從MRNA到蛋白質,肽鏈的終止及釋放,翻譯的起始,肽鏈的延伸,,,核糖體與MRNA結合并與氨基酸TRNA生成起始復合物,核糖體沿5’端向3’端移動，多肽從N端向C端合成,核糖體從MRNA上解離，準備新一輪的合成,翻譯的基本過程,將MRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開始，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。,三聯(lián)子密碼CODON的性質起始密碼子INITIATIONCODON和終止密碼子TERMINATIONCODONTRNA的特點比較原核與真核細胞核糖體的組成核糖體的活性中心信號肽葉綠體蛋白質的跨膜轉運蛋白質的翻譯后加工抗生素與蛋白質合成,UGA,UAG,UAA,AUG,,,,OCHREAMBEROPAL,,自學,氯霉素可能阻止MRNA與核糖體結合四環(huán)素類可能阻止AATRNA與核糖體結合鏈霉素、新霉素、卡那霉素等可能干擾AATRNA與核糖體結合而產生錯讀,,競爭性抑制劑,,THEENDOFCHAPTERIII,精品課件,精品課件,DNA通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代；,DNA是遺傳信息的攜帶者,DNADEPENDENTDNAPOLYMERASEDDDPDNADEPENDENTRNAPOLYMERASEDDRPRNADEPENDENTRNAPOLYMERASERDRPRNADEPENDENTDNAPOLYMERASERDDP,

簡介：第14章同位素標記技術在分子生物學實驗中的應用,中國農業(yè)大學齊孟文,標記探針,探針（PROBLE帶有檢測標記的，與被檢測目標物分子具有特異性互補反應性能的探測物分子或分子片斷。探針類別核酸探針DNA、RNA探針非核酸探針，抗體、蛋白質分子標簽等,,核酸探針,標記類別,標記核素,標記單體,摻入DNA探針的常用單體標記化合物?32PDATP，?32PDCTP，?32PUTP，?32PATP。國內供應商北京福瑞國外供應商UK,標記單體,在分子克隆操作中用于標記核酸分子的標記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在摻入核苷酸的標記過程中，只有三磷酸核苷酸的Α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用Α位磷酸被標記的三磷酸核苷酸，如Α32PDATP。而在標記5末端磷酸基團的反應中一般使用Γ位磷酸被標記的ATP。放射性的信號通過X光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。,核酸探針標記法,1雙鏈DNA探針⑴切口平移法首先用DNAASEI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后借助于ECOLIDNA聚合酶I的5→3外切酶活性，切去帶有5磷酸的核苷酸；同時利用該酶5→3聚合酶活性，使同位素標記的互補核苷酸補入缺口。這兩種活性同時作用，缺口不斷向3方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。最合適的切口平移片段一般為50500個核苷酸,產生均勻標記的探針。切口平移反應受幾種因素的影響A產物的比活性取決于Α32PDNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。BDNA酶Ⅰ的用量和ECOLIDNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。CDNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,故應使用仔細純化后的DNA。,,,切口平移法,2隨機引物法通過熱變性使模板DNA變?yōu)閱捂淒NA，隨機引物與單鏈DNA退火后，利用KLENOWFRAGMENT合成互補鏈。此時如果底物中DNTP的一種或幾種被Α32P,Α35S,3H等標記時，那么合成的互補鏈DNA也被標記。合成后的雙鏈DNA通過熱變性變成單鏈后即可用作雜交探針。,,隨機引物法,DNA標記法比較,2單鏈DNA探針,⑴從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針M13噬菌體是一種單鏈DNA噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細胞內復制成為雙鏈并繁殖，又以單鏈形式透出菌體，再度感染新的宿主菌。將模板序列克隆到M13噬菌體,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸為引物，在?32PDNTP存在下，由KLENOW片斷酶促合成標記探針，反應完畢后，酶切長短不一的產物，然后通過變性凝膠電泳與模板分離。,,⑵從RNA合成單鏈CDNA探針用RNA為模板合成CDNA探針所用的引物有兩種A寡聚DT為引物合成CDNA探針。本方法只能用于帶POLYA的MRNA,并且產生的探針極大多數偏向于MRNA3‘末端序列。B可用隨機引物合成CDNA探針。該法可避免上述缺點,產生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復雜得多,應預先盡量富集MRNA中的目的序列。反轉錄得到的產物RNA/DNA雜交雙鏈經堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經SEPHADEXG50柱層析即可得到單鏈探針。,3寡核苷酸探針,若只知道待分離的目的基因編碼的蛋白質產物，而對其核苷酸序列一無所知，即可設計合成寡核苷酸探針。利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。單一已知序列的寡核苷酸探針種類許多兼并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫,,4RNA探針,許多載體如PBLUESCRIPT,PGEM等均帶有來自噬菌體SP6或ECOLI噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的DNTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點,又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優(yōu)點，主要是RNADNA雜交體比DNADNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產生信號要強。RNARNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNARNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進行RNA結構分析比用DNA探針效果。,5末端標記,（1）一種是在5末端加成標記法先用堿性磷酸酶（AP）去掉DSDNA5磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的ATP轉移加到DNA片段5OH上。（2）在探針3末端用末端轉移酶摻入一個單標記的DDUTP。,6PCR擴增標記,在PCR擴增時加入標記的DNTP，不僅能對探針DNA進行標記還可進行大量擴增，尤其適合于探針DNA濃度很低的情形。,標記一般流程,,核酸分子雜交,互補的核苷酸序列通過WALSONCRICK堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。,雜交類型,SOUTHERN雜交,DNA片段經電泳分離后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。SOUTHERN雜交可用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟1酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。2將DNA片段轉移到固體支持物硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。3預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。4讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結合的探針。5通過顯影檢查目的DNA所在的位置。,檢測靈敏SOUTHERN雜交能很靈敏地檢測出低于01PG與32P標記的高比活性探針的109CPM/ΜG互補DNA。如果將10ΜG基因組DNA轉移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1KB大小的單拷貝序列。,,帶有DNA片段的凝膠,,SOUTHERN印跡雜交的技術流程,,電泳示意圖,凝膠電泳,轉印方法1毛細管虹吸優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長,轉移后雜交信號較弱。2電泳轉印將DNA變性后,經電泳印移至帶電荷的尼龍膜上。優(yōu)點是可直接轉移較大的DNA片段，缺點是轉移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管和真空轉移無效時,才予以采用。3真空轉移一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速,在30分鐘內就能從正常厚度45MM和正常瓊脂糖濃度1的凝膠中定量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比SOUTHERN轉移強23倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂,在洗膜不嚴格時,其背景比毛細管法的要高。,,虹吸印跡,,分子雜交爐,雜交過程,,成像觀測,放射性自顯影利用標記核素自身的放射性射線使感光材料感光成象的過程。目前常用的方法有傳統(tǒng)的膠片自顯影感光屏醫(yī)用X光片；原理爆光過程，射線粒子使X光片乳膠基質中均勻分布的溴化銀晶粒感光形成物點的潛影，然后經顯影及定影得像圖。膠片影象可在底片上直接觀察。,,X光自顯影暗盒及圖像增強屏,,成像觀測,儲存磷光屏（STORAGEPHOSPHORSCREEN）一種由磷光晶體制成的影像屏（IMAGINGPLATE。經射線爆光后IP以潛能儲存射線能，當在讀取裝置下掃描讀取時，IP在掃描激光下釋放潛能發(fā)出藍綠光，光強與爆光時射線強度成正比，用光電傳感器轉換電信號，再經模數轉換成二進制編碼信號，由計算機成象系統(tǒng)合成為影象圖。操作用塑料薄膜蓋電泳凝膠，貼附于裝于暗盒的磷光屏曝光，然后在成像儀上，通過掃描磷光屏上儲存的光能進行成象。,,UVI化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),與著名的MOLECULARDYNAMICSTMPHOSPHORIMAGERTM系統(tǒng)是一樣，臺風儲磷技術磷屏TYPHOON9000系列能對所有電離輻射源提供高分辨率圖像并精確定量3H32P14C33P125I35S18F99MTC大成像面積，高分辯光學系統(tǒng)和靈敏的磷屏組合，為您提供可靠的實驗結果。下圖給出的是用32P標記的ATLASTM微陣列MACROARRAY在GP屏上的圖像。,,成像觀測,閃爍光纖屏由塑料光纖制成的板，光纖中填有鉛和發(fā)光染料，使射線能轉換為可見光光子，然后再由電荷耦合器件CCD攝像機成像。較膠片和磷光屏的分辨率好，近實時成像且需曝光量低。,成像觀測,放射性薄層掃描儀由空間位置靈敏探測器組成核探測儀器。可用于薄層層析板、凝膠電泳轉印膜上放射性條帶的直接定位測定。,美國的BIOSCAN公司AR2000圖像掃描儀,AR2000圖像掃描儀可對所有類型同位素（包括3H）標記的TLC板、凝膠、印跡進行直接定位定量計數測量。掃描儀采用充氣式計數器，可檢測Γ和Β射線的同位素。對整塊薄層層析條帶的掃描可在1分鐘內完成。整套系統(tǒng)包括一個儀器控制和數據采集軟件，掃描結果以層析圖或2D圖像顯示，自動完成對峰的定量，并以多種方式顯示結果。應用于TLC板、凝膠和印跡不需破壞TLC板即可進行定量對所有類型同位素（包括3H）靈敏簡單易用的WINSCAN軟件快速、自動、可靠的運行提供出色的空間分辨率針對1、2、3塊TLC板可選擇不同的型號2D彩色圖像主要應用于放射化學純度、脂類生物化學、代謝研究、酶分析、毒理學研究等領域。,,瑞士卡瑪產地德國,同位素薄層掃描儀技術參數掃描面積為400200MM（GITA,RITA）50200MMMINIGITA,MINIRITA掃描速度可選軌道數目180檢測器ΓRADIATIONBGODETECTOR，?RADIATIONGMCOUNTINGTUBE，GASFLOW檢測能量范圍02000KEV可檢測的放射物ΓRADIATIONBGOSCINTILLATIONPROBE背景129I07CPS20100KEV靈敏度129I20BQIN10MIN分辨率129I23MMDEPENDINGONTHEUSEDCOLLIMATOR可檢測的放射物?RADIATIONOPENPROPORTIONALCOUNTINGTUBERECOMMENDEDFOR3HREQUIRESCOUNTINGGASP1090AR10CH4背景18F01CPS靈敏度18F10BQIN10MIN分辨率18F12MM,防護措施,,,INSPECTOR,NORTHERN雜交,NORTHERN雜交與SOUTHERN雜交很相似,主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性劑主要有3種乙二醛，甲醛，羥甲基汞。電泳后的瓊脂糖凝膠用與SOUTHERN轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。,菌落原位雜交,對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。,,菌落原位雜交,,斑點雜交,斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。,,DNA序列分析,SANGER雙脫氧鏈終止法CAMBRIDGE的FSANGER于1977年發(fā)明。基本原理①DNA聚合酶能夠以單鏈DNA作為模板，準確合成的DNA互補鏈；②該酶能夠用2，3雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，DA，DT，DG，DC和一種DDNTP。常用KLENOW大片段，無5→3外切酶活性。,,DNA序列分析,MAXAMGILBERT化學修飾法哈佛大學對一個末端標記的DNA片段，用化學試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段。把反應分為四組，每一組反應特異性地針對某一種或某一類堿基，并且要保證每個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾，這樣，在每一組反應中都在同一個或兩個核苷酸處DNA鏈發(fā)生斷裂，由于堿基位置不同，就會產生一組不同長度的DNA片段。最后，經過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影后就可讀出待測DNA的核苷酸序列。,化學修飾法,,MAXAMGILBERT法所用的化學修飾技術,DNA序列分析,DNA序列分析自動化用四甲基若丹明TETRAMETHYLRHODAMINE作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導下發(fā)出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應，跑DNA凝膠后用計算機檢測。,,熒光標記物,,,,,,DDGTP,DDATP,DDTTP,DDCTP,,,,,,,,,,,,,單泳道電泳及信號收集,,,,,,,,,正極,負極,,,,,,,,,,計算機排序,5ˊ,GSFLX系統(tǒng)超高通量測序技術原理GSFLX系統(tǒng)的測序原理和GS20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個DNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來圖1。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、靈敏度高和自動化的特點。,GSFLX系統(tǒng)的操作過程GSFLX系統(tǒng)提供了完整的從樣品制備到后續(xù)的生物信息學分析解決方案。1）樣品種類GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定包括基因組DNA，PCR產物，BAC，CDNA，小分子RNA等等。2）樣品DNA打斷樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800BP的片段；對于小分子的非編碼RNA，這一步驟則不需要。短的PCR產物則可以利用GS融合引物進行擴增后直接進行步驟4的工作。3）銜接子連接借助一系列標準的分子生物學技術，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DN段上。接頭也將在后繼的純化，擴增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續(xù)步驟中要用到的單鏈的DN段。,GSFLX系統(tǒng)的操作過程4）一條DNA片段＝一個磁珠接頭使成百上千條DN段結合到它們自己唯一的磁珠上，此磁珠被單個油水混合小滴包被后，在這個小滴里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；整個DN段進行平行擴增。5）一個磁珠＝一條讀長經過PCR擴增后，每個磁珠上的DN段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經過富集以后，這些片段仍然和磁珠結合在一起，隨后就可以放入到PICOTITERPLATE板中供后繼測序使用了。6）數據讀取和分析工具GSFLX系統(tǒng)在75小時的運行當中可獲得40多萬個讀長，讀取超過1億個堿基信息。GSFLX系統(tǒng)提供三種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用于不同的應用例如多達3GB序列的重測序，對比已知參考序列進行的擴增產物差異分析，及120MB的從頭測序工作等。,,備注,焦磷酸測序PYROSEQUENEING是通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測的測序技術。既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核昔酸多態(tài)性SINGLE年NUELEOTIDEPOLYMOHISM，SNP檢測及等位基因頻率測定。焦磷酸測序是由DNA聚合酶DNAPOLYMERASE、三磷酸腺酰硫酸化酶ATPSULFURYLASE、熒光素酶LUCIFERASE和雙磷酸酶APYRASE4種酶催化同一反應體系的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，反應底物為5’磷酰硫酸ADENOSINES5’PHOSPHOSUIFATE，ASP）,,備注,和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加人1種DNTP，若該DNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻人到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團PPI。硫酸化酶催化APS和PPI形成ATP，后者驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由PYROGRAMMT轉化為一個峰值，其高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。根據加人DNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核昔酸序列。,DNA序列分析,DNA雜交測序法SBHSEQUENCINGBYHYBRIDIZATION如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結構，則可認為靶DNA上存在著相應的互補序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。如果將一種12MER的靶DNA與完全隨機合成的8MER寡核苷酸探針混合雜交，在總數為4865536種8MER的探針群體中，僅有5種探針會與靶DNA雜交，形成完全互補的雙鏈分子。,DNA雜交測序法,SBH的應用①可有效檢測靶DNA中的單堿基突變；②可用于不同DNA片段之間的序列比較；③可用于檢測不同生長發(fā)育狀態(tài)下細胞中特定基因的表達狀況；④可用于檢驗傳統(tǒng)測序技術的準確性。,蛋白質研究技術,WESTERN免疫印跡將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。WESTERNBLOT采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。,,WB,,PCR應用,1PCR技術的原理無細胞克隆法以擬擴增的DNA片段為模板，一對分別與模板互補的寡核苷酸為引物，在4種脫氧核苷酸（DNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所結合的位置向3’方向合成新的互補鏈。其反應以雙鏈DNA的變性、退火、延伸為一個循環(huán)。經過多次循環(huán)（2530次），便目標DNA片段得以大量擴增。由于每一次循環(huán)所產生的新鏈均可成為新的模板用于下一輪循環(huán)，故PCR產物以指數方式增加。,MULLIS的PCR構思,,,預變性9395?C,25M,變性9395?C,30S,復性5070?C,30S,延伸75?C,3060S,總延伸75?C,7M,,,,,,2535,PCR的一般過程,經過30次的循環(huán),擴增的DNA片段可達100萬倍以上。,PCR技術的原理,PCR步驟（1）高溫變性，雙鏈DNA變性（90～95℃）成為單鏈；（2）低溫退火（3760℃），引物與單鏈DNA互補序列結合；（3）適溫延伸，DNA聚合酶催化（7075℃）使引物延伸。（4）重復（1）（3）步。,PCR技術的原理,實驗材料、儀器和試劑1材料含1KB插入片段的克隆載體PMD18T質粒DNA2儀器微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設備3試劑10XPCR反應緩沖液25MMOL/LMGCL210MMOL/LDNTP10ΜMOL/L引物1和引物2,PCR操作步驟,1按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻10XPCR反應緩沖液25ΜL25MMOL/LMGCL220ΜL10MMOL/LDNTP10ΜL10ΜMOL/L引物110ΜL10ΜMOL/L引物210ΜL質粒DNA10ΜLTAQ01ΜL5U水補充至250ΜL,2PCR循環(huán),,PCR儀,,3反應完成后,將反應液與凝膠電泳緩沖液按比例混勻,上樣電泳。,PCR操作步驟,,,,PCR應用,,PCR應用,2與標記相結合的應用LPPCRLABELLEDPRIMERS利用同位素、熒光素等對PCR引物進行標記，可用以直觀的檢測目的基因，特別適合于臨床基因診斷，同時可以檢測多種基因成分。,PCR應用,2與標記相接合的應用原位PCRISPCR以整個細胞作為反應體系，對目的基因進行擴增，然后通過原位雜交等不破壞細胞結構的方法進行檢測的方法。其檢測標本一般為細胞涂片或組織切片，適合低拷貝靶序列的檢測。可用于細胞內的病毒感染、基因重排，以及基因表達的檢測。,

簡介：中國考博輔導首選學校中國考博輔導首選學校生物化學與分子生物學生物化學與分子生物學考博專業(yè)課重點整理考博專業(yè)課重點整理（7）八、磷酸戊糖途徑磷酸戊糖途徑是指從G6P脫氫反應開始，經一系列代謝反應生成磷酸戊糖等中間代謝物，然后再重新進入糖氧化分解代謝途徑的一條旁路代謝途徑。該旁路途徑的起始物是G6P，返回的代謝產物是3磷酸甘油醛和6磷酸果糖，其重要的中間代謝產物是5磷酸核糖和NADPH。整個代謝途徑在胞液中進行。關鍵酶是6磷酸葡萄糖脫氫酶。九、磷酸戊糖途徑的生理意義1是體內生成NADPH的主要代謝途徑NADPH在體內可用于⑴作為供氫體，參與體內的合成代謝如參與合成脂肪酸、膽固醇等。⑵參與羥化反應作為加單氧酶的輔酶，參與對代謝物的羥化。⑶維持巰基酶的活性。⑷使氧化型谷胱甘肽還原。⑸維持紅細胞膜的完整性由于6磷酸葡萄糖脫氫酶遺傳性缺陷可導致蠶豆病，表現(xiàn)為溶血性貧血。2是體內生成5磷酸核糖的唯一代謝途徑體內合成核苷酸和核酸所需的核糖或脫氧核糖均以5磷酸核糖的形式提供，其生成方式可以由G6P脫氫脫羧生成，也可以由3磷酸甘油醛和F6P經基團轉移的逆反應生成。（ＰＳ（ＰＳTHEWAYTOCONTACTYUMINGKAOBOTELSILINGLINGLIULIUBALIUJIUQIBAQQWUSIQILINGLIUSANBALIUER）十、糖原的合成與分解糖原是由許多葡萄糖分子聚合而成的帶有分支的高分子多糖類化合物。糖原分子的直鏈部分借Α14糖苷鍵而將葡萄糖殘基連接起來，其支鏈部分則是借Α16糖苷鍵而形成分支。糖原是一種無還原性的多糖。糖原的合成與分解代謝主要發(fā)生在肝、腎和肌肉組織細胞的胞液中。1糖原的合成代謝糖原合成的反應過程可分為三個階段。⑴活化由葡萄糖生成尿苷二磷酸葡萄糖葡萄糖→6磷酸葡萄糖→1磷酸葡萄糖→UDPG。此階段需使用UTP，并消耗相當于兩分子的ATP。⑵縮合在糖原合酶催化下，UDPG所帶的葡萄糖殘基通過Α14糖苷鍵與原有糖原分子的非還原端相連，使糖鏈延長。糖原合酶是糖原合成的關鍵酶。中國考博輔導首選學校中國考博輔導首選學校全身各組織細胞攝取利用的過程稱為脂肪動員。激素敏感脂肪酶（HSL）是脂肪動員的關鍵酶。HSL的激活劑是腎上腺素、去甲腎上腺素和胰高血糖素；抑制劑是胰島素、前列腺素E2和煙酸。脂肪動員的過程為激素膜受體→腺苷酸環(huán)化酶↑→CAMP↑→蛋白激酶↑→激素敏感脂肪酶（HSL，甘油三酯酶）↑→甘油三酯分解↑。脂肪動員的結果是生成三分子的自由脂肪酸（FFA）和一分子的甘油。脂肪酸進入血液循環(huán)后須與清蛋白結合成為復合體再轉運，甘油則轉運至肝臟再磷酸化為3磷酸甘油后進行代謝。2脂肪酸的Β氧化體內大多數的組織細胞均可以此途徑氧化利用脂肪酸。其代謝反應過程可分為三個階段1活化在線粒體外膜或內質網進行此反應過程。由脂肪酸硫激酶（脂酰COA合成酶）催化生成脂酰COA。每活化一分子脂肪酸，需消耗兩分子ATP。2進入借助于兩種肉堿脂肪酰轉移酶（酶Ⅰ和酶Ⅱ）催化的移換反應，脂酰COA由肉堿（肉毒堿）攜帶進入線粒體。肉堿脂肪酰轉移酶Ⅰ是脂肪酸Β氧化的關鍵酶。⑶Β氧化由四個連續(xù)的酶促反應組成①脫氫脂肪酰COA在脂肪酰COA脫氫酶的催化下，生成FADH2和ΑΒ烯脂肪酰COA。②水化在水化酶的催化下，生成LΒ羥脂肪酰COA。③再脫氫在LΒ羥脂肪酰COA脫氫酶的催化下，生成Β酮脂肪酰COA和NADHH。④硫解在硫解酶的催化下，分解生成1分子乙酰COA和1分子減少了兩個碳原子的脂肪酰COA。后者可繼續(xù)氧化分解，直至全部分解為乙酰COA。3三羧酸循環(huán)生成的乙酰COA進入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解。三、脂肪酸氧化分解時的能量釋放以16C的軟脂酸為例來計算，則生成ATP的數目為一分子軟脂酸可經七次Β氧化全部分解為八分子乙酰COA，故Β氧化可得5735分子ATP，八分子乙酰COA可得12896分子ATP，故一共可得131分子ATP，減去活化時消耗的兩分子ATP，故軟脂酸可凈生成129分子ATP。對于偶數碳原子的長鏈脂肪酸，可按下式計算ATP凈生成數目（碳原子數21）5（碳原子數2）122。

簡介：分子生物學大實驗課在碩士研究生培養(yǎng)中的作用分子生物學大實驗課在碩士研究生培養(yǎng)中的作用G42306文獻標識碼A21世紀是生命科學的時代，生命科學發(fā)展迅猛，前沿不斷拓展，內涵不斷深化，新技術新方法層出不窮，日新月異，目前生命科學在各個領域都取得了巨大的進展，使生命科學在自然科學中的地位發(fā)生了革命性的變化。作為快速發(fā)展的、連續(xù)性與承接性很強的實驗科學，需親自動手來開展研究，實驗性要求高，扎實的動手能力、合理的規(guī)劃能力與嚴謹的研究態(tài)度及實事求是的科學精神等是研究生做好自己的科學研究工作的必備條件。因此，通過實施開展分子生物學大實驗課，對新入學的碩士研究生進行系統(tǒng)的分子生物學實驗技能的培訓與考核，以增強他們的實驗動手能力與科學研究的素養(yǎng)，以便形成認真、踏實的科研工作作風和實事求是、嚴謹、一絲不茍的學習態(tài)度。1分子生物學大實驗課的必要性1121世紀分子生物學發(fā)展的趨向在發(fā)展和危機并存的21世紀，生命科學將成為自然科學的帶頭學科。基因組研究的重點正在由“結構”向功能轉移，一個以基因組功能研究為主要研究內容的“后基因組”（POSTGENOMICS）時代已經到來。它是對成千上萬的基因表達進行分析和比較，從基因組整體水平上闡述基因活動的規(guī)律。這門新學科的形成，是在后基因組時代生物學的研究重點。功能基因組學的主要任務，是研究細胞全部基因的表達圖式和全部蛋白圖式，或者說“從基因組到蛋白質握的現(xiàn)代生物學的主要研究方法及科研素質參差不齊，遲遲地難以融入科研實踐，明顯地影響了高等院校和科研院所的研究生培養(yǎng)質量，造成研究生獨立開展工作的能力和實際的動手能力都比較差，致使學術水平、創(chuàng)新能力及團隊精神等研究生教育的質量指標呈現(xiàn)下滑的趨勢。高等院校研究生教育的根本目標是培養(yǎng)具有科學精神、創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力的高層次專業(yè)人才；同時，研究生又是高等院?？茖W研究任務的主要承擔者，研究生培養(yǎng)質量的好壞，不僅是人才培養(yǎng)質量問題，更與我國的生物科學技術發(fā)展水平密切相關，關乎21世紀分子生物學的發(fā)展。因此，以增強研究生實驗動手能力及科研素質為目標，通過開展分子生物學大實驗課，完善研究生實驗課程的教學體系，幫助研究生形成認真、踏實的科研工作作風、團隊精神和合作交流意識，以及實事求是、一絲不茍的學習態(tài)度和工作作風是非常必要的。2分子生物學大實驗課的設置高等院校生命科學各專業(yè)的碩士研究生需適應時代發(fā)展的要求，既要學習分子生物學理論和分子生物學技術的基本知識，還必須系統(tǒng)地培養(yǎng)自己在分子生物學方面的技術素養(yǎng)與動手能力。分子生物學實驗技術包含諸多領域，如PCR技術、分子克隆技術、核酸與蛋白質的提取與分離、生物大分子制備和分析常用技術、分子雜交與印跡技術、外源基因轉移技術、蛋白質表達技術、分子標記技術、分子改造技術、測序及人工合成技術、基因組學技術、蛋白質組學技術、生物信息學技術、RNA研究技術等。因此，在構置分子