簡介：點(diǎn)擊查看更多蛹蟲草多糖的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：結(jié)核病作為全球性的健康問題，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢(shì)。分枝桿菌MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最為重要的傳染性病原體之一，它能夠在宿主巨噬細(xì)胞中持續(xù)存活，每年引起八百萬人感染，其中有三百萬病人由于得不到合理的治療而死亡。此外，在過去40年以來，一直沒有開發(fā)出治療效果比異煙肼更優(yōu)的藥物。而多耐藥菌株MUTIDRUGRESISTANT，MDR的出現(xiàn)和廣泛傳播，以及與艾滋病的共同作用，使得結(jié)核病的疫情進(jìn)一步惡化。開發(fā)更有效、更快速的抗結(jié)核新藥，徹底攻克結(jié)核病已勢(shì)在必行。結(jié)核桿菌的基因組含4000多個(gè)基因，其中有250個(gè)基因編碼脂肪酸代謝相關(guān)的酶，和大腸桿菌相比多了4倍有余。結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁以肽聚糖為基本架構(gòu)，共價(jià)結(jié)合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸，它和結(jié)核桿菌的毒力、結(jié)核桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力息息相關(guān)。另外，細(xì)胞壁所含的脂類約占細(xì)胞壁干重的60％等等，這些事實(shí)均說明了脂肪酸代謝對(duì)結(jié)核桿菌的重要性。丙二酰COAACP轉(zhuǎn)化酶MALONYCOAACPTRANSACYLASE，MCAT是脂肪酸代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化MALONYLCOA形成MALONYLACP，后者進(jìn)入脂肪酸碳鏈延長循環(huán)，每次增加2個(gè)碳原子。ACPACYLCARRIERPROTEIN是FASII系統(tǒng)中的小且酸性的蛋白，它在脂肪酸代謝中起著重要作用，與大分子脂肪酸的合成及結(jié)核細(xì)胞壁的裝配緊密相關(guān)。ACP與MCAT都是很好的抗結(jié)核藥物靶位的候選對(duì)象。本論文共克隆、表達(dá)、純化了結(jié)核桿菌的兩個(gè)MCAT和三個(gè)可能的ACP蛋白，并檢測(cè)了這些蛋白的一些生理生化功能及特性。在酶活測(cè)定中，我們了解到FABD和FABD2的性能相近，幾種二價(jià)陽離子對(duì)酶活的影響不大；RVL344轉(zhuǎn)錄的蛋白確實(shí)具有載酰功能，而RV0033可能在別的通路中發(fā)揮作用。RTPCR試驗(yàn)闡明了兩個(gè)MCAT蛋白在結(jié)核桿菌侵入巨噬細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄情況，其中FABD的表達(dá)上調(diào)，而FABD2表達(dá)量減少，證實(shí)了結(jié)核桿菌兩個(gè)MCAT蛋白在結(jié)核病急性及持續(xù)感染中的重要性。通過WESTERN檢測(cè)，耐藥菌株感染的病人血清和敏感株病人血清中都具有ACPL344的抗原，說明了ACPL344的重要性及它作為結(jié)核診斷的輔助指標(biāo)的可能。此外，我們還通過RVL344基因的定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)，驗(yàn)證了ACPL344蛋白中一些序列的重要性與保守性。圓二色譜的測(cè)定，使我們得到了幾種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了獲得這些蛋白的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出活性小分子化合物，我們還與清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室合作，對(duì)這些蛋白進(jìn)行了晶體生長的嘗試性實(shí)驗(yàn)。最終得到兩個(gè)MCAT的晶體，其中FABD的分辨率在2A，而FABD2晶體的分辨率只有6A。最后，我們解析出FABD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。雖然未能得到ACPL344的晶體結(jié)構(gòu)，我們?nèi)杂猛茨＝ǖ姆椒ǎ玫搅嗽摰鞍啄M的三維結(jié)構(gòu)，為設(shè)計(jì)有活性的小分子化合物打下良好基礎(chǔ)。

簡介：第一部分目的比較潰瘍性結(jié)腸炎患者與無器質(zhì)性腸道疾病志愿者腸黏膜NFΚBP65表達(dá)差異，探討其臨床意義。方法募集12名無器質(zhì)性腸道疾病志愿者（男女各6名，平均年齡4613±1205歲）與16名潰瘍性結(jié)腸炎患者（男性患者10名，女性患者6名，平均年齡5042±1043歲），電子結(jié)腸鏡下取活檢獲得新鮮的腸黏膜組織。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)其基因表達(dá)，免疫熒光染色檢測(cè)NFΚBP65蛋白表達(dá)強(qiáng)度，T檢驗(yàn)分析兩組之間的差異。結(jié)果無器質(zhì)性腸道疾病志愿者腸黏膜NFΚBP65基因與蛋白表達(dá)量分別為053±024、210％±064％，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜NFΚBP65基因與蛋白表達(dá)量分別為519±337、1522％±316％，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P結(jié)論本文在前人基礎(chǔ)上再次證實(shí)NFΚBP65參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，以此為切入點(diǎn)進(jìn)行深入研究可能為該病的診斷與治療帶來突破。第二部分目的比較潰瘍性結(jié)腸炎患者與結(jié)直腸癌患者腸黏膜NFΚBP65表達(dá)差異，探討其臨床意義。方法12名無器質(zhì)性腸道疾病志愿者、16名潰瘍性結(jié)腸炎患者及18名結(jié)直腸腺癌患者被納入實(shí)驗(yàn)，電子結(jié)腸鏡或手術(shù)取活檢獲得新鮮的腸黏膜組織。逆轉(zhuǎn)錄聚核酶鏈反應(yīng)法（RTPCR）檢測(cè)各組腸黏膜NFΚBP65MRNA的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)各組腸黏膜NFΚBP65蛋白表達(dá)強(qiáng)度，單因素方差分析三組之間的差異。結(jié)果無器質(zhì)性腸道疾病志愿者腸黏膜NFΚBP65基因與蛋白表達(dá)量分別為010±003、206％±070％，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜NFΚBP65基因與蛋白表達(dá)量分別為096±011、3616％±699％，結(jié)直腸癌患者腸黏膜NFΚBP65基因與蛋白表達(dá)量分別為042±077、954％±277％，三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P結(jié)論盡管炎癥與腫瘤存在某種聯(lián)系已在學(xué)界達(dá)成共識(shí)，課題組也觀察到結(jié)直腸癌患者腸黏膜NFΚBP65的表達(dá)較無器質(zhì)性腸道疾病志愿者增加，但其表達(dá)強(qiáng)度并非之前文獻(xiàn)報(bào)道的那么高，課題組認(rèn)為抑制NFΚBP65的表達(dá)可能是治療潰瘍性結(jié)腸炎的較好思路，但不認(rèn)為抑制NFΚBP65的表達(dá)能從根本上治療結(jié)直腸癌。第三部分目的比較分化程度不同的大腸癌患者與無器質(zhì)性腸道疾病志愿者腸黏膜血管緊張素Ⅱ（ANGIOTENSINⅡ，ANGⅡ）及其Ⅰ型受體（AT1R）表達(dá)差異，初步探討ANGIIAT1R信號(hào)通路與大腸癌之間的關(guān)系。方法腸鏡室募集大腸癌患者24名（病理學(xué)檢查證實(shí)其中9名為大腸高分化腺癌患者，9名為大腸中分化腺癌患者，6名為大腸低分化腺癌患者）及6名無器質(zhì)性腸道疾病志愿者，電子結(jié)腸鏡下取活檢獲得新鮮的腸黏膜組織。免疫組化法檢測(cè)各組腸黏膜ANGIOTENSINⅡ及AT1R蛋白表達(dá)強(qiáng)度，單因素方差分析各組之間的差異。結(jié)果大腸腺癌患者腸黏膜ANGⅡ和AT1R的表達(dá)較無器質(zhì)性腸道疾病志愿者腸黏膜ANGⅡ和AT1R表達(dá)明顯增強(qiáng)（P005）；中、低分化組較高分化組AT1R表達(dá)增加（P結(jié)論ANGIIAT1R信號(hào)通路參與大腸癌的發(fā)病過程，可能成為大腸癌治療的新靶點(diǎn)。第四部分目的探討難治性肛瘺的中西醫(yī)結(jié)合治療方法并初步總結(jié)其療效。方法病例納入標(biāo)準(zhǔn)為同意接受本中西醫(yī)結(jié)合治療方法的難治性低位肛瘺患者（外口離肛緣2CM以上的患者），剔除以下病例一些能利用肛瘺切開術(shù)輕易治愈的單純性肛瘺患者、直腸陰道瘺患者、直腸膀胱瘺患者、炎癥性腸病患者、肛門先天異?；颊?、有肛門失禁病史患者及有手術(shù)禁忌癥的患者。手術(shù)主要器械為瘺管銑刀，術(shù)后主要方藥為拔毒生肌散與黃連膏，治療簡要操作步驟如下肛周常規(guī)消毒→麻醉滿意→鋪無菌巾→肛管內(nèi)碘伏棉球消毒→擴(kuò)肛并確認(rèn)病情→探針由外口探入從內(nèi)口穿出→在與內(nèi)口對(duì)應(yīng)的距肛緣15CM處作一與瘺管走行方向一致的梭形切口作為新外口→沿探針切開新外口與內(nèi)口之間的皮膚、皮下組織及瘺管→組織剪修整所切的皮肉組織呈“V”狀敞開→銑刀桿循探針由外口探入從開窗處穿出→退出探針→銑刀頭安裝在肛內(nèi)由開窗處穿出的銑刀桿上→位于外口之銑刀桿尾部連接微型電機(jī)→微型電機(jī)接通電源的同時(shí)術(shù)者持電機(jī)緩緩拉出轉(zhuǎn)動(dòng)的銑刀→適當(dāng)撐擴(kuò)殘余瘺道→再次將探針從外口探入開窗處探出→利用探針將引流條引入殘存瘺道→每日雙氧水替硝唑生理鹽水沖洗傷口→早期傷口引流物渾濁階段，用蘸有拔毒生肌散的凡士林紗條引流；后期傷口引流物清稀階段，用蘸有黃連膏的凡士林紗條引流→適時(shí)拔除引流條。結(jié)果2009年8月至2009年11月間，課題組運(yùn)用本中西醫(yī)結(jié)合療法治療8例低位單純性肛瘺患者及6例低位復(fù)雜性肛瘺患者（男12名，女2名，平均年齡355±1287歲），隨訪半年結(jié)果顯示1例未堅(jiān)持換藥的患者術(shù)后1月復(fù)發(fā)，其他13例患者均痊愈；平均住院日為7天，患者傷口愈合時(shí)間為4143±610天；無1例患者出現(xiàn)術(shù)中術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥。結(jié)論本中西醫(yī)結(jié)合療法之手術(shù)部分一方面清除了感染的肛腺并作一“V”型切口至肛緣，最大限度的保證術(shù)后不復(fù)發(fā)；另一方面機(jī)械化的隧道式切除瘺管壁肉芽組織而非全程切開瘺道，操作簡單、高效、微創(chuàng)；術(shù)后換藥階段融入辨證換藥理念，早期利用蘸有提膿祛腐方藥的凡士林紗條引流，后期用蘸有清熱解毒、消腫止痛方藥的凡士林紗條引流，確保腐去新生。早期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示本中西醫(yī)結(jié)合療法是治療難治性肛瘺的一個(gè)較佳選擇，其療效好、創(chuàng)傷小，值得大力探索并加以推廣。

簡介：圍絕經(jīng)期綜合征（PEIRMENOPAUSALPERIODSYNDROME，PPS），是婦女在絕經(jīng)前后，雌激素水平下降，引起神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，免疫功能下降和植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的綜合征。肝郁是PPS重要病機(jī)。本研究運(yùn)用證素辨證的方法對(duì)PPS肝郁及其兼雜特點(diǎn)展開研究，探討肝郁證的兼雜特征及其與植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等常見癥狀之間的關(guān)系。同時(shí)從單胺類等神經(jīng)遞質(zhì)水平研究產(chǎn)生肝郁及其兼雜證的物質(zhì)基礎(chǔ)，并從基因?qū)用娣治鰢^經(jīng)期綜合征肝郁及其兼雜特征的易感性，以深化對(duì)PPS肝郁的病機(jī)認(rèn)識(shí)，同時(shí)為PPS的肝郁的早期診斷及防治提供客觀的依據(jù)。第一部分圍絕經(jīng)期綜合征證素分布及肝郁兼雜特征與常見癥狀的相關(guān)性研究目的分析PPS婦女的病位病性規(guī)律和肝郁的兼雜特征，探討PPS常見癥狀與肝郁病理及其兼雜特征的相關(guān)性。方法收集PPS患者459例，采集相關(guān)臨床資料，以證素辨證的方法分析PPS的病位病性證素特征，肝郁兼雜特征，對(duì)PPS常見證素進(jìn)行聚類分析，分析肝郁及其兼雜與PPS常見癥狀的關(guān)系。結(jié)果1PPS前六位常見癥狀依次為感覺異常6449％，失眠5948％，易激動(dòng)5468％，眩暈4793％，骨關(guān)節(jié)痛、肌肉痛4619％，潮熱汗出4357％2PPS病位涉及心、肝、脾、肺、腎、胞宮、胃、膽、大腸和膀胱。肝為最多7255％P＜001，其次為腎、脾和胞宮P＜001。3PPS實(shí)證病性涉及氣滯、痰、濕、血瘀、熱、寒。氣滯為最多達(dá)5839％，以氣滯、痰、濕、血瘀為主P＜0014PPS虛證病性涉及陰虛、氣虛、血虛、陽虛、陽亢、精虧。其中以陰虛為最多6972％P＜001，其次為氣虛、血虛和陽虛P(yáng)＜001，再次為陽亢。5PPS常見病位病性證素聚類顯示氣滯、血瘀、痰和肝為一大類，氣虛、陽虛、血虛、陰虛、脾、腎、濕為一大類，其余病性病位為一大類。6PPS的常見癥狀中，肝郁組的眩暈發(fā)生率低于非肝郁組P＜005，骨關(guān)節(jié)痛、肌肉痛發(fā)生率高于非肝郁組P＜005，其他癥狀發(fā)生率無差別。7PPS肝郁兼雜特征病位兼雜主要為腎、脾和胞宮實(shí)證病性兼雜主要為痰、血瘀、濕、和熱虛證病性兼雜主要為陰虛、氣虛、血虛、陽虛。8PPS肝郁兼雜特征對(duì)其常見癥狀的影響肝郁病位兼腎者潮熱汗出的發(fā)生率高于病位不兼腎者P＜005肝郁兼血瘀者骨關(guān)節(jié)痛肌肉痛的發(fā)生率顯著高于無兼血瘀者P＜001，潮熱汗出、失眠的發(fā)生率高于無兼血瘀者P＜005肝郁兼熱的抑郁發(fā)生率高于無兼熱者P＜005肝郁兼氣虛者心悸的發(fā)生率顯著高于無兼氣虛者P＜001，泌尿系癥狀發(fā)生率高于無兼氣虛者P＜005肝郁兼陰虛者泌尿系癥狀發(fā)生率顯著高于無兼陰虛者P＜001肝郁兼血虛者泌尿系癥狀發(fā)生率高于無兼血虛者（P＜005）。結(jié)論1PPS是多個(gè)臟腑功能失調(diào)的結(jié)果，病性涉及寒熱虛實(shí)，其中主要病位在肝、腎、脾、胞宮實(shí)證以氣滯、痰、濕、血瘀為主虛證以陰虛、氣虛、血虛、陽虛為主。實(shí)證多與肝有關(guān)，虛證多與腎、脾有關(guān)。2PPS肝郁常兼腎、脾、胞宮的病理變化，也常兼痰、血瘀、濕、和熱之實(shí)證，和陰虛、氣虛、血虛、陽虛的虛證。3PPS肝郁及其兼雜特征會(huì)影響PPS常見癥狀的表現(xiàn)形式。第二部分圍絕經(jīng)期綜合征肝郁及其兼雜特征的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究一、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁與神經(jīng)遞質(zhì)的相關(guān)性研究目的觀察PPS肝郁及其兼雜特征與神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系，探討PPS肝郁及其兼雜特征的部分分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法應(yīng)用ELISA等方法檢測(cè)189例PPS患者血液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（5羥色胺5HT，去甲腎上腺素NE，多巴胺DA）以及Β內(nèi)啡肽ΒEP。比較PPS肝郁組和非肝郁組神經(jīng)遞質(zhì)差異，比較肝郁不同兼雜神經(jīng)遞質(zhì)差異。結(jié)果1肝郁組總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素顯著高于非肝郁組P＜001，肝郁組FSH高于非肝郁組P＜001。2基于肝郁LOGISTIC回歸中，進(jìn)入方程的自變量是直接膽紅素、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶P＜001。3肝郁組的DA和NE較非肝郁組為低P＜0054肝郁病位兼腎者DA和5HT顯著低于單純肝郁者P＜001肝郁兼痰者DA顯著低于無痰者P＜001，5HT低于無痰者P＜005肝郁兼濕者5HT顯著低于無濕者P＜001肝郁兼熱者5HT顯著低于無熱者P＜001肝郁兼氣虛者5HT顯著低于無氣虛者P＜001肝郁兼血虛者DA和5HT均顯著低于無血虛者P＜001肝郁兼陰虛者DA和5HT均低于無陰虛者P＜005。結(jié)論1PPS患者DA和NE的降低可能是肝郁發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。2PPS單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化與肝郁兼雜特點(diǎn)密切相關(guān)。3總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素可以做為PPS肝郁辨證的客觀依據(jù)之一。二、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁與雌激素受體基因多態(tài)性相關(guān)性研究目的觀察PPS肝郁及其兼雜特征與ER基因型的關(guān)系，挖掘PPS肝郁及其兼雜特征的易感因素方法應(yīng)用探針法檢測(cè)189例PPS患者血液中ERΑRS9340799AG、ERΒRS1256030CT，RS3020444TC多態(tài)性。結(jié)果1肝郁組的ERΒRS3020444TT頻率8593％高于與非肝郁組6557％P＜001，其余基因型分布無差異。PPSERΒRS3020444為TT型的患者發(fā)生肝郁證的相對(duì)危險(xiǎn)度為3208。2肝郁患者ERΒRS3020444和ERΒRS1256030的TTCC頻率高于非肝郁者P＜005，肝郁患者ERΒRS3020444和ERΑRS9340799的TTAG的頻率高于非肝郁者P＜005，TCAG和CCAG的頻率低于非肝郁者P＜005。3肝郁兼濕、兼痰ERΒRS3020444基因型分布分別與無濕，無痰者有差異（P＜005），肝郁兼熱、兼氣虛ERΒRS1256030基因型分布分別與無熱、無氣虛者有差異P＜005，肝郁兼濕、兼氣虛、兼血虛、兼陽虛ERΑRS9340799基因型分布分別與無濕、無氣虛、無血虛、無陽虛有差異P＜005。結(jié)論1ERΒRS3020444TT型可能是PPS肝郁證的遺傳易感基礎(chǔ)之一。2PPS肝郁兼雜的易感性與ERΑRS9340799、ERΒRS3020444、ERΒRS1256030基因型有關(guān)。

簡介：分類號(hào)密級(jí)洳?！?、嗜博士學(xué)位論文⑧單位代碼10335學(xué)號(hào)蝕Z幽30英文論文題目叢Q壁壁墜魚RID鲴TI丞ATIQNA曲FU璉￡廿ONALCHARACTERIZATIONOFUBIQUITINENZVMESUBE2DCNARACTERLZANONOLUBLAULNNENZVMESLUB．匕ZJLJANDUIP5INABALONE辦口Z湯￡西枷口煅記D勛，S耽巫PN汜睨口ANA0VSTER一R口鼴口．S辦℃口口N口庀P托。SZS論文提交日期至Q坌生魚旦⑧AUTHOR’SSIGNATURESUPERVISOR’SSIGNATUREXTEMALREVIEWERSEXAMININGCOMMITTEECHAI印ERSONPROF．SIFALIEXAMININGCOMMITTEEMEMBERS里￡Q￡￡塾墜世I望Y蠡迅G￡Q￡LI塹西迪麴PROFXIAOLIUDATEOFORALDEF；MCE』墜墜星壘竺，2Q12

簡介：點(diǎn)擊查看更多基于制備環(huán)境的家蠶絲膠蛋白分子形態(tài)構(gòu)象與生物學(xué)性能研究.pdf精彩內(nèi)容。

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簡介：河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲得的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名為單位河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)法律責(zé)任。研究生簽名锍導(dǎo)師簽章掃霧吁二級(jí)學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)尊章‘。O心年歲月，J日河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名中文摘要乳腺癌ET方案新輔助化療前后分子生物學(xué)指標(biāo)變化的分析摘要目的回顧性分析乳腺癌患者行新輔助化療前后其腫瘤組織ER、PR、HER2及KI67的免疫組化表達(dá)情況，觀察應(yīng)用ET方案進(jìn)行新輔助化療對(duì)乳腺癌分子生物學(xué)指標(biāo)的表達(dá)有無影響。方法本研究選擇河北醫(yī)科大學(xué)第四院乳腺中心2010年1月至2014年8月收治的女性原發(fā)性乳腺癌患者82例，患者新輔助化療方案均為ET方案，在新輔助化療前均行粗針穿刺明確診斷并行免疫組化檢查明確ER、PR、HER2及KI67的表達(dá)情況，新輔助化療4周期后實(shí)施手術(shù)治療，術(shù)后標(biāo)本同樣行免疫組化檢查明確腫瘤細(xì)胞ER、PR、HER2及KI67的表達(dá)情況，并對(duì)其新輔助化療前后的ER、PR、HER2及KI67的表達(dá)狀況進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌新輔助化療前后有38例患者KI67的表達(dá)發(fā)生改變，占8085％38／47，其中表達(dá)增強(qiáng)的L例，減弱的37例，無陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃圆±?，陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮缘?0例；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)得出新輔助化療前后KI67的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005；ER表達(dá)有14例患者發(fā)生改變，占2979％14／47，其中表達(dá)增強(qiáng)的5例，減弱的9例，陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘?例，陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮缘?例；PR表達(dá)有17例發(fā)生改變，占3617％17／47，其中表達(dá)增強(qiáng)的6例，減弱的11例，陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘?例，陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮缘?例；HER2的表達(dá)有9例發(fā)生改變，占2308％9／39，其中表達(dá)增強(qiáng)的2例，減弱的7例，陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘?例，陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮缘?例；但ER、PR、HER2在新輔助化療前后的表達(dá)狀況無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義胗O05。結(jié)論乳腺癌應(yīng)用ET方案行新輔助化療，分子生物學(xué)指標(biāo)中ER、PR、HER2、KI67的免疫組化表達(dá)在新輔助化療前后均有部分病例發(fā)生改變，但本研究中僅發(fā)現(xiàn)KI67新輔助化療前后的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO05；其變化主要體現(xiàn)在由新輔助化療前的高表達(dá)，轉(zhuǎn)變?yōu)榛熀笫中g(shù)標(biāo)本的低表達(dá)，表明高表J。KKI67的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療較為敏感，KI67是一項(xiàng)化療敏感指標(biāo)，對(duì)預(yù)測(cè)療效有重要的指導(dǎo)意義。ER、PR、HER2的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

簡介：目的探討無遷徙生長現(xiàn)象碳青酶稀耐藥奇異變形桿菌生物學(xué)特性、耐藥機(jī)制及分子分型特點(diǎn)，為院內(nèi)感染防控提供指導(dǎo)。此外，通過比較遷徙生長奇異變形桿菌與無遷徙生長奇異變形桿菌耐藥譜差異，為臨床針對(duì)該類細(xì)菌抗感染治療提供科學(xué)依據(jù)。方法回顧分析2013年1月至2014年12月武警杭州醫(yī)院臨床分離的奇異變形桿菌耐藥率收集其中碳青霉烯類耐藥無遷徙奇異變形桿菌，菌株經(jīng)過多次傳代并觀察有無遷徙生長現(xiàn)象，通過半固體培養(yǎng)及鞭毛染色實(shí)驗(yàn)觀察菌株動(dòng)力及鞭毛利用脈沖凝膠電泳PFGEPULSEDFIELDGELELECTROPHESIS分析菌株之間同源性采用瓊脂稀釋法及ETEST法進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用ESBLS雙紙片實(shí)驗(yàn)和改良HODGE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表型確證，表型實(shí)驗(yàn)陽性菌株采用PCR方法和測(cè)序分析明確耐藥基因型。運(yùn)用S1PFGE聯(lián)合SOUTHERN印跡雜交及質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對(duì)碳青霉烯耐藥基因進(jìn)行定位，并分析耐藥基因周圍環(huán)境。最后對(duì)電轉(zhuǎn)子進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增和藥敏驗(yàn)證。結(jié)果無遷徙生長奇異變形桿菌生物學(xué)特性通過比較菌體鞭毛染色發(fā)現(xiàn)，鏡下無遷徙菌株菌體小且規(guī)則并明顯缺失鞭毛結(jié)構(gòu)在半固體穿刺培養(yǎng)中只能沿穿刺線生長，不能沿線外蔓延擴(kuò)散，推測(cè)可能由于無遷徙菌株，鞭毛結(jié)構(gòu)缺失而失去遷徙生長的能力。兩種奇異變形桿菌生化特性相同。在不同培養(yǎng)基中生長情況提示，在含有膽鹽的麥康凱、SS平板上，兩種奇異變形桿菌均不能形成遷徙生長的菌落，群集運(yùn)動(dòng)消失。本次研究共統(tǒng)計(jì)奇異變形桿菌339株，其中無遷徙細(xì)菌42株遷徙菌對(duì)亞胺培南與美羅培南耐藥率分別為63％與32％，無遷徙菌耐藥率分別為572％與524％，兩種形態(tài)菌株對(duì)碳青霉烯耐藥率具有顯著差異42株無遷徒奇異變形桿菌中，碳青霉烯類耐藥的奇異變形桿菌為24株，占57％。對(duì)該24株碳青霉烯類耐藥無遷徙生長奇異變形桿菌進(jìn)行PFGE同源性分析，結(jié)果提示分為3個(gè)克隆型，以克隆A型（2224株）流行為主，所有菌株改良HODGE實(shí)驗(yàn)均為陽性，且均攜帶BLAKPC2基因，菌株動(dòng)力實(shí)驗(yàn)及鞭毛染色均為陰性SOUTHERN印跡雜交表明BLAKPC2基因分別定位在約為26KB，55KB，139KB不同大小質(zhì)粒上部分菌株在攜帶BLAKPC2基因的質(zhì)粒上同時(shí)攜帶BLATEM1、BLACTXM65、RMTB等多種耐藥基因攜帶BLAKPC2基因菌株周圍結(jié)構(gòu)顯示，其上游含有插入元件ISKPN8，下游則由插入元件ISKPN6LIKE構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)易導(dǎo)致耐藥基因在種屬間水平傳播。臨床資料回顧發(fā)現(xiàn)，該類細(xì)菌多數(shù)分離自呼吸道，病人多為氣管切開狀態(tài)，患者有住院時(shí)間長，大量使用廣譜抗生素的特點(diǎn)。結(jié)論無遷徙生長奇異變形桿菌因鞭毛結(jié)構(gòu)缺失而失去遷徙生長的能力。該類菌具有較高碳青霉烯類抗生素的耐藥率，產(chǎn)KPC2型碳青霉烯酶是導(dǎo)致無遷徙奇異變形桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。碳青霉烯耐藥無遷徙生長奇異變形桿菌在我院呈克隆播散趨勢(shì)，應(yīng)引起臨床高度重視。

簡介：分類號(hào)墨墨墨壘2密級(jí)洳≥J～涪博士學(xué)位論文⑧單位代碼幽學(xué)號(hào)LLQL2Q32提交日期2Q蘭生壘目壟蘭旦MOLECULARBIOLOGYOFD批P25OF彳掰而哦聊廳口C口西紗掃，萬記口NUCLEOPOLYHEDROVIRUSIVAUTHOR’SSIGNATUREN●■●JSUPERVLS0R7SSLGNATUREEXTEMALREVIEWERSEX鋤ININGCONML№ECHAI印ERSONGH曼塾GI魚旦GQQ塾G里墅Q魚墨墨Q￡SQQ魚HQ塑墮墜IY曼囟蟻EXAMIILINGCO舢ILITTEEMEMBERS基I墜GM曼塾GL旦里Q魚墨墨Q蘭H自I壘壘G墮塾＆曼墨鰱YY塑G塑叢I壘Q￡￡Q墼墨Q圣蜮I墊G墮塾IY曼堡I鯉至墜I壘塾GH墜里￡Q魚墨墨Q圣魚自I壘墜G也IY星墨量YXI墊魚墜G迎￡煦魚墨墨Q丕H自I塹G坐撾?yún)材珨?shù)DATEOFORALDEFENCE6．7．2013

簡介：引言外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫FATALBACTERIAGRANULOMAAFTERTRAUMA，F(xiàn)BGT是由高天文教授發(fā)現(xiàn)并命名的一種新疾病，該病在面部外傷愈合后發(fā)生，預(yù)后極差，患者死亡時(shí)均有腦部受累癥狀。以往國內(nèi)多位專家曾先后診治過近20例，進(jìn)行了認(rèn)真的普通細(xì)菌分離、厭氧菌分離、真菌培養(yǎng)等研究，均未獲陽性結(jié)果；曾診為“結(jié)節(jié)病、真菌感染”，給予糖皮質(zhì)激素、抗生素、抗結(jié)核、抗真菌等治療，效果不佳，患者全部在發(fā)病后的1到4年內(nèi)死亡。在總結(jié)、分析前人分離、培養(yǎng)該病病原失敗的基礎(chǔ)上，采取嚴(yán)格厭氧、運(yùn)送培養(yǎng)基及增菌肉湯等改進(jìn)措施后，本課題組其他成員終于成功地從4例FBGT患者的皮損組織中分離培養(yǎng)出病原菌，初步研究表明該菌為革蘭陽性桿菌，但具體種屬不明。由于病原菌種屬、患者的致死機(jī)理等不明，盡管采取各種積極的治療措施，除我們所救治的6例患者中有1例獲救外，至今尚無救治成功的病例。FBGT的發(fā)病機(jī)制、致死機(jī)理的闡明已成為救治患者的關(guān)鍵。目的1分別采取PCR擴(kuò)增FBGT患者皮損分離病原菌16SRRNA、測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)及患者分離菌與PACNES標(biāo)準(zhǔn)株DNA雜交方法明確病原菌的種屬；采用細(xì)菌16SRRNAPCR的方法，檢測(cè)2例行尸檢患者病例2和3的病變腦組織是否存在細(xì)菌，闡明患者死亡原因，測(cè)序結(jié)果與皮損分離菌序列比對(duì)，明確腦內(nèi)細(xì)菌是否與各自患者皮損分離菌為同一細(xì)菌，進(jìn)一步證實(shí)從患者皮損分離的細(xì)菌就是FBGT的病原菌。2通過PCR擴(kuò)增病例2的IFNΓ相關(guān)分子IAM，包括IFNΓR1、R2、STAT1、IL12Β、IL12RΒ1、Β2和STAT4的所有外顯子，測(cè)序結(jié)果與多個(gè)數(shù)據(jù)庫的野生型序列比較，尋找可能引起相應(yīng)的IAM分子功能缺陷的多態(tài)性位點(diǎn)，初步明確FBGT的發(fā)病機(jī)制。方法1FBGT患者皮損分離病原菌分子生物學(xué)鑒定及死亡原因分析14例FBGT患者皮損分離病原菌16SRRNA鑒定1提取皮損分離菌的基因組DNA；2利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增皮損分離菌的16SRRNA；3測(cè)序結(jié)果通過BLAST與已知細(xì)菌的16SRRNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，明確FBGT患者皮損分離菌的具體種屬。2皮損分離病原菌與PACNES標(biāo)準(zhǔn)株DNA雜交1DNA結(jié)合采用共價(jià)法結(jié)合DNA到微孔板法進(jìn)行DNADNA雜交，每個(gè)樣品4個(gè)平行重復(fù)；2標(biāo)記DNAPHOTOACTIVATABLEBIOTINPAB標(biāo)記探針DNA；3雜交4測(cè)定雜交率50℃雜交12小時(shí)，分別用2SSC01％TWEEN2050℃和室溫洗3次15分鐘，堿性磷酸酶法FLUOSTAROPTIMABMD測(cè)定雜交率360NM激發(fā)和460NM輻射。32例死亡患者病變腦組織細(xì)菌16SRRNA檢測(cè)、死亡原因分析1提取2例行尸檢患者病例2和3的病變腦組織基因組DNA；2病變腦組織細(xì)菌16SRRNAPCR檢測(cè)，明確患者死亡原因；3測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步明確病變腦組織內(nèi)細(xì)菌的種屬，并與各自患者皮損分離菌的16SRRNA序列進(jìn)行比較，明確病變腦組織內(nèi)的細(xì)菌與皮損分離菌是否為同一細(xì)菌，進(jìn)一步證實(shí)皮損分離菌就是FBGT的病原菌。2IAM基因外顯子擴(kuò)增、功能缺陷多態(tài)性位點(diǎn)確定在本課題第一部分已明確PACNES就是FBGT的致病菌的基礎(chǔ)上，通過綜合分析FBGT患者的表型，結(jié)合PACNES毒力低，為胞內(nèi)寄生菌等特點(diǎn)，充分借鑒他人研究成果，提出了IAM基因多態(tài)性是FBGT發(fā)病的重要機(jī)制的假說。進(jìn)行了以下工作1設(shè)計(jì)IAM相關(guān)分子基因所有外顯子包含5和3端的片區(qū)的引物，并對(duì)引物進(jìn)行BLAST比對(duì)，確保特異擴(kuò)增；2PCR擴(kuò)增，直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與多個(gè)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫EGPGSWASHINGTONEDU、GENECARD等的野生型序列比較，找出多態(tài)性位點(diǎn)；3針對(duì)此多態(tài)性位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)引物，無關(guān)正常對(duì)照10人的相應(yīng)外顯子PCR擴(kuò)增，直接測(cè)序，證實(shí)正常人不存在此多態(tài)性位點(diǎn)；4通過PCR單酶切分析進(jìn)一步證實(shí)病例2的多態(tài)性位點(diǎn)，并明確等位基因型；5綜合分析所發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)三維構(gòu)像等、表達(dá)和功能可能的影響，進(jìn)而確認(rèn)能引起相應(yīng)分子功能缺陷的多態(tài)性位點(diǎn)，初步明確FBGT的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果1FBGT患者皮損分離病原菌16SRRNA鑒定、病變腦組織細(xì)菌16SRRNA檢測(cè)和死亡原因分析14例FBGT患者皮損分離病原菌16SRRNA基因序列經(jīng)BLAST比對(duì)后與已知PACNESAB0972151GI26006299的同源性達(dá)99％，皮損分離病原菌為PACNES22例尸檢患者病變腦組織內(nèi)均可檢測(cè)到細(xì)菌16SRRNA片段，患者死于細(xì)菌引起的腦感染；PCR測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)患者皮損分離菌的16SRRNA序列完全一致，腦內(nèi)細(xì)菌與皮損分離菌為同一細(xì)菌。2IAM基因外顯子擴(kuò)增、功能缺陷多態(tài)性位點(diǎn)確定1通過PCR測(cè)序與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)IAM重要成員IL12RΒ1基因第五外顯子存在一個(gè)錯(cuò)義突變271G→A，可引起所編碼氨基酸的改變91T→A，未發(fā)現(xiàn)其他IAM分子基因外顯子存在無義或錯(cuò)義突變；2檢索多個(gè)多態(tài)性數(shù)據(jù)庫EGPGSWASHINGTONEDU、GENECARD等，未發(fā)現(xiàn)與IL12RΒ1基因第五外顯子錯(cuò)義突變271G→A一致的多態(tài)性位點(diǎn)；310名正常對(duì)照IL12RΒ1基因第五外顯子在相應(yīng)多態(tài)性位點(diǎn)均為野生型271GG；4PCRNAEI單酶切分析進(jìn)一步證實(shí)病例2的IL12RΒ1基因第五外顯子突變?yōu)闉榧兒闲湾e(cuò)義突變271AA5IL12RΒ1的錯(cuò)義突變271G→A位于配體識(shí)別的關(guān)鍵區(qū)域，該突變可引起所編碼氨基酸的理化性質(zhì)改變疏親水性，進(jìn)而引起IL12RΒ1三維構(gòu)像改變，綜合分析證實(shí)此錯(cuò)義突變271G→A可引起IL12RΒ1與配體結(jié)合能力下降，導(dǎo)致IL12RΒ1功能缺陷。結(jié)論1本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法明確了PACNES為新疾病FBGT的病原，患者的死亡原因?yàn)镻ACNES所致的腦感染。2依據(jù)FBGT的臨床特點(diǎn)，通過廣泛查閱相關(guān)文獻(xiàn)，提出IAM基因多態(tài)性引起相應(yīng)分子功能的缺陷是FBGT發(fā)病機(jī)制的假說；以此為基礎(chǔ)，檢測(cè)了病例2的IAM基因的所有外顯子，發(fā)現(xiàn)IAM的重要成員IL12RΒ1第5外顯子存在1個(gè)錯(cuò)義突變271G→A，綜合分析發(fā)現(xiàn)該突變可引起編碼氨基酸疏水性改變，突變氨基酸位于配體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，可引起IL12RΒ1與配體結(jié)合能力下降，導(dǎo)致IL12RΒ1功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致IAM的核心分子IFNΓ表達(dá)障礙，通過對(duì)1例患者的深入研究，證實(shí)了提出的FBGT發(fā)病機(jī)制假說。

簡介：目的1鑒于惡性血液病真菌感染日趨嚴(yán)重，探討惡性血液病合并真菌感染的分子生物學(xué)診斷方法，以達(dá)到對(duì)真菌感染的早期診斷的目的。2隨著抗真菌藥物的廣泛使用，耐藥菌株逐漸增多，對(duì)菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)對(duì)常用抗真菌藥物的敏感性。方法1采取患者靜脈血進(jìn)行常規(guī)血液培養(yǎng)；對(duì)血培養(yǎng)陽性樣本進(jìn)行菌株鑒定，并鑒定到種；使用改良的真菌DNA提取法進(jìn)行基因提??；使用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行基因擴(kuò)增；使用MSPI酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得序列與GENBANK核酸庫已登錄的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。2使用ATBFUNGUS3試條進(jìn)行藥敏試驗(yàn)?？拐婢幬飪尚悦顾谺（AMB）、5氟胞嘧啶（5FC）、氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）。結(jié)果1在500人份可疑真菌感染的全血標(biāo)本中，共檢出陽性樣本115份。酶切鑒定結(jié)果為白色念珠菌48株417％，熱帶念珠菌27株235％，光滑念珠菌16株139％、克柔念珠菌11株96％、近平滑念珠菌8株70％、其他5株43％。與血培養(yǎng)分離鑒定結(jié)果基本一致。2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與酶切結(jié)果完全一致。PCRRFLP檢測(cè)和鑒定結(jié)果與血培養(yǎng)法有較好的一致性，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義（P005）。3真菌主要為白色念珠菌，占417％。體外抗真菌藥敏試驗(yàn)對(duì)兩性霉素B（AMB）、5氟胞嘧啶（5FC）、氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）平均敏感率分別100％、9722％、6850％、7778％和8148％。其中對(duì)兩性霉素B、5氟胞嘧啶敏感性最好，耐藥率分別為0％和278％。對(duì)氟康唑的敏感性最差，耐藥率為3150％。結(jié)論1使用PCRRFLP進(jìn)行菌株鑒定的技術(shù)敏感性、特異性高，與常規(guī)血培養(yǎng)方法比較耗時(shí)短，可以對(duì)真菌感染進(jìn)行早期的診斷，有一定的臨床意義。2真菌感染主要由白色念珠菌、熱帶念珠菌引起。感染菌株對(duì)兩性霉素B，5氟胞嘧啶保持較高的體外活性，兩者是治療真菌的有效藥物。

簡介：目’錄摘要，IABSTRACT111第1章文獻(xiàn)綜述，111納米技術(shù)概述，112納米粒子的基本性質(zhì)213納米顆粒的制備，414納米顆粒的表面改性和包覆修飾615磁性納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究916納米顆粒的生物安全性及其影響因素研究，1417本論文研究的目的、意義及主要內(nèi)容，15第2章磁性納米粒子的制備、修飾和表征1721引言，1722材料與方法、1723結(jié)果和討論1824本章小結(jié)22第3章氧化硅包裹的磁性納米粒子在質(zhì)粒DNA分離中的應(yīng)用，2331引言，，，，2332材料與方法，，，，，2433結(jié)果和討論‘二，，，，，2634本章小結(jié)，，，，，、37第4章氧化硅包裹的磁性納米粒子純化質(zhì)粒DNA的下游應(yīng)用，3841引言一‘”“，3842材料與方法，3843結(jié)果和討論‘‘”，”二3944本章小結(jié)‘，，”45第5章磁性納米粒子對(duì)細(xì)胞的毒性651弓，言，二，，4652材料和方法，，“”””，465，3結(jié)果和討論，二，，，，4854本章小結(jié)，，、51第6章全文總結(jié)，，，52參考文獻(xiàn)，，53致謝，，，，63在校期間發(fā)表論文及參加課題情況”“、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文里膽口皿里國口里國坦用量等對(duì)質(zhì)粒DNA純度和收率的影響。結(jié)果表明當(dāng)鹽酸呱濃度為4MOUL，溶液C的PH值為45，整個(gè)操作在室溫完成時(shí)，能夠從15而過夜培養(yǎng)的大腸桿菌LB培養(yǎng)液中純化得到13陀的高純度質(zhì)粒DNA，整個(gè)過程不需接觸酚、氯仿等有機(jī)試劑，在20而N內(nèi)完成，操作簡便，無須分離柱，避免了離心和真空操作，重復(fù)性好。隨后，將上述提純的質(zhì)粒DNA用于分子生物學(xué)下游操作，進(jìn)行了限制酶切、轉(zhuǎn)化萬COLIDHSQ感受態(tài)細(xì)胞再次抽提質(zhì)粒、測(cè)序等檢測(cè)，以評(píng)價(jià)基于氧化硅包裹的磁性納米粒子的純化方法。結(jié)果表明采用氧化硅包裹的磁性納米粒子抽提得到的質(zhì)粒DNA，完全達(dá)到了分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)的要求，本文建立的質(zhì)粒DNA提取方法穩(wěn)定可靠。最后，利用SRB法檢測(cè)了自制的磁性納米粒子對(duì)A549人肺癌腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，同時(shí)將用氧化硅包裹的磁性納米粒子抽提的質(zhì)粒DNAPGEX4T一EGFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增后細(xì)菌培養(yǎng)液表達(dá)強(qiáng)烈熒光。結(jié)果表明自制的磁性納米粒子對(duì)A549人肺癌腫瘤細(xì)胞無抑制作用，對(duì)質(zhì)粒DNA的生理活性無不良影響，具有良好的生物相容性。關(guān)鍵詞氧化硅磁性納米粒子質(zhì)粒DNA純化細(xì)胞毒性

簡介：目的1應(yīng)用SELDITOFMS技術(shù)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒HCMV感染導(dǎo)致臨床個(gè)體致肝炎綜合征血清學(xué)和HCMV感染相關(guān)細(xì)胞的神經(jīng)瘤細(xì)胞內(nèi)、外液蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)，建立與HCMV致病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物篩選方法；2建立可調(diào)控的針對(duì)HCMV即刻早期基因的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并檢測(cè)即刻早期基因?qū)?xì)胞抗凋亡的影響，以此探討可能的機(jī)理。材料和方法1取臨床HCMV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征CONGENITALHUMANCYTOMEGALOVIRUSHEPATITIS患兒20例作為實(shí)驗(yàn)組，三個(gè)對(duì)照組25例血清標(biāo)本肝功能情況檢測(cè)、CMV特異性IGM抗體及尿CMV基因定量檢測(cè)，分離并制備蛋白，與WCX2蛋白質(zhì)芯片相互作用，利用SEIDITOFMS技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液中分子量在500020000DA范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，繪制出蛋白飛行質(zhì)譜，在BIOMARKERWIZARD軟件的輔助下，分析差異蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)，在SWISS蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì)差異蛋白進(jìn)行初步鑒定。2選擇人星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y，按細(xì)胞數(shù)量之比為101的比例將兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)，感染HCMVAD169株。病毒感染神經(jīng)瘤細(xì)胞6H后，RTPCR的方法檢測(cè)HCMVIE基因的表達(dá)水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察HCMV感染對(duì)神經(jīng)瘤細(xì)胞凋亡的影響；體外培養(yǎng)U251，細(xì)胞，細(xì)胞感染病毒后不同時(shí)間段收獲細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收獲正常細(xì)胞為對(duì)照組，使用基于SELDI技術(shù)的時(shí)間飛行質(zhì)譜儀和WCX2芯片，檢測(cè)各組之間細(xì)胞內(nèi)、外液蛋白表達(dá)譜的差異。將各組蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較，并將相關(guān)蛋白峰在SWISS蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找與病毒的感染及發(fā)病相關(guān)的蛋白分子。3利用已有質(zhì)粒PIE72，設(shè)計(jì)人巨細(xì)胞病毒HCMV即刻早期基因IE1的特異性引物，進(jìn)行IE1基因的擴(kuò)增、提純、鑒定，構(gòu)建重組的可調(diào)控真核表達(dá)載體PTRE2HYGIE1，純化質(zhì)粒。4常規(guī)培養(yǎng)TETONHELA細(xì)胞，以陽離子高效轉(zhuǎn)染試劑HIFECTINⅡ轉(zhuǎn)染細(xì)胞。首先在培養(yǎng)的HELA細(xì)胞中轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEIN，EGFP報(bào)道基因，在普通熒光顯微鏡下觀察顯示綠色熒光的HELA細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率；在轉(zhuǎn)染EGFP基因的基礎(chǔ)上，體外常規(guī)培養(yǎng)TETONHELA細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PTRE2HYGIE1重組質(zhì)粒，經(jīng)G418和潮霉素雙重篩選，RTPCR和WESTERNBLOT和免疫組織化學(xué)方法鑒定IE1的表達(dá)。5終濃度為100NGML的腫瘤壞死因子A作用于HELA細(xì)胞，建立HELA細(xì)胞的凋亡曲線；不同終濃度的DOXCYCLINE01ΜGML、1ΜGML和10ΜGML作用轉(zhuǎn)染PTRE2HYGIE1的HELA細(xì)胞，誘導(dǎo)IE1表達(dá)，RTPCR方法檢測(cè)IE1基因的產(chǎn)生，WESTERNBLOT檢測(cè)IE1蛋白的產(chǎn)生水平，MTT法檢測(cè)HELA細(xì)胞的細(xì)胞增值率。結(jié)果1HCMV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征組與各對(duì)照組比較，血清中有4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，在SWISS蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索到分子量為58116DA、79356DA和88993DA的蛋白峰分別與Β防御素8、巨噬細(xì)胞源性趨化因子和血小板堿性蛋白在分子量和等電點(diǎn)上非常接近。2HCMV感染的兩個(gè)組與無HCMV感染的兩組嬰兒比較，血清中共有5個(gè)蛋自質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，其中56390DA、59096DA、77765DA和158332DA的蛋白峰分別與促胸腺生成素、Β淀粉樣前體蛋白A4、血小板因子4和白細(xì)胞介素25在分子量和等電點(diǎn)上非常接近。3HCMV隱性感染組與其他組比較，血清中有2個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，57107DA的蛋自峰與Β防御素31非常接近。4兩個(gè)先天性嬰兒肝炎綜合征組與肝功能正常的另兩組嬰兒比較，血清中有4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，其中75676DA、137441DA、150928DA、159316DA的蛋白峰分別與巨噬細(xì)胞炎性蛋白4、前白蛋白、肝再生增強(qiáng)因子和結(jié)合珠蛋白非常接近。5RTPCR的方法檢測(cè)HCMVIE基因的表達(dá)用于證實(shí)HCMV感染，成功建立了神經(jīng)瘤細(xì)胞的HCMV感染模型。病毒感染1天后細(xì)胞無明顯變化，感染3天后細(xì)胞在G1峰左側(cè)出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體細(xì)胞群的峰亞G1峰，即凋亡峰，感染5天后細(xì)胞凋亡峰明顯。6病毒感染后細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨病毒感染時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡明顯增加。感染后3天和6天的細(xì)胞凋亡率分別為41％和426％。與正常對(duì)照組比較，分子量為26316DA、12027DA和135363DA的蛋白峰在病毒感染后表達(dá)持續(xù)上調(diào)，HCMV感染后4H略有增高，病毒感染后48H明顯升高。通過在SWISS數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)其蛋白峰的分子量和等電點(diǎn)分別與CASPASE1、TNFA、Β淀粉樣前體蛋白非常接近。7構(gòu)建的真核表達(dá)載體PTRE2HYGIE1序列測(cè)定正確。DOX調(diào)控的重組表達(dá)載體PTRE2HYGIE1體外轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞后，經(jīng)G418和潮霉素B雙重篩選，獲得一株穩(wěn)定表達(dá)IE1的HELA細(xì)胞株。梯度濃度的DOXCYCLINE01ΜGML、1ΜGML和10ΜGML作用PTRE2HYGIE1HELA細(xì)胞48H，RTPCR檢測(cè)DOX誘導(dǎo)表達(dá)的MRNA比值IE1ΒACTIN分別為0733，0917和1768，WESTERNBLOT檢測(cè)IE1蛋白，IE1ΒACTIN分別為132，583和707。8終濃度為100ΜGML的TNFA和25ΜGML的ACTD聯(lián)合作用于轉(zhuǎn)染IE1質(zhì)粒的HELA細(xì)胞后，MTT檢測(cè)HELA細(xì)胞增值率顯示轉(zhuǎn)染IE1的細(xì)胞在8H之內(nèi)細(xì)胞活性大于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，CASPACE檢測(cè)CASPASE3表達(dá)量分別為06±0029、16±0041和185±0065，而未轉(zhuǎn)染IE1的HELA細(xì)胞CASPASE3表達(dá)量分別為085±0061、26±0058和45±0065。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組比值差異有顯著意義P001，從而證明轉(zhuǎn)染后的IE1HELA細(xì)胞具有顯著抗凋亡功能，細(xì)胞學(xué)觀察也證實(shí)這一點(diǎn)。結(jié)論1建立了HCMV感染引起的先天性嬰兒肝炎綜合征人群的血清蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫和HCMV感染神經(jīng)瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)、外液差異蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫，并發(fā)現(xiàn)了HCMV臨床個(gè)體及細(xì)胞學(xué)改變的有意義的蛋白質(zhì)組學(xué)指標(biāo)。2HCMV感染過程持續(xù)增高的細(xì)胞蛋自因子，可能與HCMV感染所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡有關(guān)。3可調(diào)控表達(dá)外源基因的TETON質(zhì)粒，可以在DOX誘導(dǎo)下，表達(dá)與DOX劑量依賴的外源插入基因編碼蛋白HCMVIE1，可抑制細(xì)胞凋亡。

簡介：分類號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻空間誘變生物學(xué)效應(yīng)及分子多態(tài)性的初探STUDIESONTHEBIOLOGICALEFFEETANDMOLECULARPOLYMORPHISMOF形CEMUTANTSFROMSPAEE幾GHT研究生羅華程指導(dǎo)教師羅利軍教授指導(dǎo)小組羅利軍教授余舜武副研究員梅捍衛(wèi)研究員劉灶長研究員陳亮副研究員專業(yè)作物生物技術(shù)獲得學(xué)位名稱農(nóng)學(xué)碩士研究方向水稻分子生物學(xué)獲得學(xué)位時(shí)間2008年6月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院二00八年六月223多態(tài)性片段的回收與分析20224突變株系的RTPCR分析20225突變體種子的直鏈淀粉和蛋白質(zhì)含量測(cè)定21226突變株系的抗旱性213結(jié)果與分析2231突變體主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)22311空間誘變處理對(duì)突變體生育期的影響22312空間誘變處理對(duì)突變體株高的影響22313空間誘變處理對(duì)突變體葉型的影響22314空間誘變處理對(duì)突變體穗型的影響2332突變體的分子檢測(cè)，24321SSR和INDEL標(biāo)記的多態(tài)率24322突變株系的突變方式25323突變體的突變序列分析26324突變位點(diǎn)的功能預(yù)測(cè)28325突變體的AFLP標(biāo)記篩選2833突變體突變基因在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)分析29331苗期突變株系的表達(dá)分析29332分集期突變株系的表達(dá)分析30333抽穗期突變株系的表達(dá)分析3034突變體代謝產(chǎn)物分析‘31341突變體種子直鏈淀粉含量分析31342突變體種子蛋白質(zhì)含量分析，3135突變株系抗旱性初步分析犯4討論，3341空間誘變的農(nóng)藝性狀分析3342空間誘變的多態(tài)性分析3443空間誘變的突變位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析3544部分突變基因功能的預(yù)測(cè)分析3645突變株系376的分析和探討3646空間誘變效應(yīng)的探討‘37參考文獻(xiàn)，39致謝47附錄48附錄一AFLP的引物組合48附錄二CTAB法提取大量DNA流程48附錄三RNA的小量提取49附錄四DNA消化處理DNASEL處理49附錄五第一鏈CDNA的合成50附錄六RT一PCR擴(kuò)增保守片段50附錄七DNA片段的回收一51附錄八PCR產(chǎn)物的克隆51