簡介:,干細(xì)胞產(chǎn)品技術(shù)服務(wù),,,,ORICELLTM,ORICELLTM,,,,最新產(chǎn)品,1ES成神經(jīng)元分化試劑盒;2ES成心肌分化試劑盒;,3ES成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒;4MSC成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒;5NSC成神經(jīng)元分化試劑盒;,6NSC成星型膠質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒;,目錄,胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和技術(shù)介紹,成體干細(xì)胞的常見問題與解決方案,1細(xì)胞和培養(yǎng)(干細(xì)胞、原代細(xì)胞產(chǎn)品和試劑)2細(xì)胞分化(多個(gè)方向的標(biāo)準(zhǔn)方法)3細(xì)胞示蹤(GFP/RFP和定制方法),干細(xì)胞凍存和復(fù)蘇方案干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù),,,,STEMCELL,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),MESENCHYMALSTEMCELLS是一種多能干細(xì),胞;,胚胎干細(xì)胞(ES),EMBRYONICSTEMCELLS是一種全能的干細(xì),胞,神經(jīng)干細(xì)胞(NSC),NEURALSTEMCELL是一種神經(jīng)系統(tǒng)的多能干,細(xì)胞,,,,PRIMARYCELL,神經(jīng)元系統(tǒng)(多個(gè)來源和物種,海馬、皮層)星型膠質(zhì)細(xì)胞(多個(gè)物種皮層)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞;,肝臟前體細(xì)胞;,分離其他客戶定制細(xì)胞;,,,,胚胎干細(xì)胞,,,,胚胎干細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞EMBRYONICSTEMCELLES,細(xì)胞是指胚泡期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細(xì)胞無限增殖、自我更新,可分化為三個(gè)胚層來源的各種組織及細(xì)胞類型,ES細(xì)胞的來源5D胚胎,ABCD,,,,,ES生長特性,鼠生長快,胰酶消化,2天傳一次,可一傳多。,復(fù)蘇率較高。,人生長慢,機(jī)械分離,710天傳一次,相,對較少。1416。,復(fù)蘇率低。,,,,,,,表面抗原的表達(dá),OCT4一種轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)育全能性的標(biāo)志。,堿性磷酸酶(AKP)常被用來作為鑒定ES,細(xì)胞及其分化與否的重要標(biāo)志。,SSEA1小鼠ES表達(dá),SSEA3、SSEA4人ES表達(dá),,,,染色體結(jié)構(gòu),核型分析正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,46,XX;46,XY,,,核型檢測46,XX,多能性和全能性體內(nèi)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)特定抗,擬胚體,特定條件誘體免疫導(dǎo)/自然分化組化,體外分化,去除飼養(yǎng)層細(xì)胞,,,,,全能性,體內(nèi)畸胎瘤實(shí)驗(yàn),體外去除飼養(yǎng)層細(xì)胞,擬胚體(EB,EMBRYOIDBODY。為ES細(xì)胞懸浮,生長自發(fā)分化形成,含有內(nèi)中外三個(gè)胚層組織,能基本上模擬體內(nèi)的發(fā)育過程;貼壁誘導(dǎo);,特定條件誘導(dǎo)/自然分化(除去LIF)各胚層特定抗體免疫組化檢測,體內(nèi)畸胎瘤檢測,血管組織呼吸道上皮,鱗狀上皮,腺體組織脂肪組織,,,,體內(nèi)分化,外胚層鱗狀上皮、神經(jīng)組織等,中胚層骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等內(nèi)胚層柱狀上皮、腸管樣組織等,,,,體外分化形態(tài),ES貼壁誘導(dǎo),EB約57天后出現(xiàn)自主性搏動,,129MOUSE,HUMANES,,,,免疫組化檢測,NESTINECTODERMTROPONINMESODERM,TUBULINECTODERMAFPENDODERM,,,,神經(jīng)分化貼壁誘導(dǎo)第2天,神經(jīng)分化貼壁誘導(dǎo)第5天,,,,IHCΒ‐3TUBLIN,特異性抗原的表達(dá)情況,抗原人ES鼠ES,OCT4,NANOG,SSEA1ˉ,SSEA3ˉ,SSEA4ˉ,不斷有新的蛋白標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)和論證,,,,堿性磷酸酶染色,,,,小鼠ES流式圖,,,,染色體結(jié)構(gòu),核型分析正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,人(46,XX),鼠(40,XY,,,,性別分析,性別通過PCR的方法鑒定,目的基因是基因組,DNA的Y染色體相關(guān)基因TSPY,陽性對照用X,染色體相關(guān)基因POLA1以及GAPDH。,,ESCLONE,MESGFP,HUMANESGFP,,,,MEF細(xì)胞ES成功的一個(gè)重要因素,CYAGEN提供的MEF經(jīng)過ΓIRRADIATION處理,,確保所有的細(xì)胞都完全失去增殖能力,又可以保證最佳支持和分泌能力,同時(shí)沒有任何化學(xué)有毒物質(zhì)的污染,為你ES細(xì)胞提供最佳的生長環(huán)境;為ES的增殖提供多種因子;,,,,實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查普遍結(jié)果,據(jù)CYAGEN對多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的53個(gè)ES細(xì)胞,的樣品進(jìn)行檢測,45被支原體污染;,沒有嚴(yán)格質(zhì)量控制和環(huán)境控制的情況下制作的,MEF有35以上是攜帶支原體,這個(gè)數(shù)據(jù),還根據(jù)操作技術(shù)不成熟,使用動物污染嚴(yán)重情況,風(fēng)險(xiǎn)也會大大的增加;,,,,絲裂霉素‐C(MITOMYCINC),A、長期接觸絲裂霉素‐C,藥物毒性將嚴(yán)重影響操作人員的身體健康;(單位量10‐30UG/ML處理20個(gè)10CMDISH需要3‐6MG),B、絲裂霉素‐C溶液的不穩(wěn)定,4℃保存,也會快速降解,導(dǎo)致處理的細(xì)胞不能完全失活,這將嚴(yán)重影響后面實(shí)驗(yàn)分析;,C、絲裂霉素‐C的殘留,微量的絲裂霉素‐C也會造成ES細(xì)胞增殖抑制和分化;(因?yàn)槠涫羌?xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合劑),,,,,OCT4SSEA1SSEA4,AAA,BBB,CCC,,,,ES細(xì)胞培養(yǎng)的過程,如何準(zhǔn)備狀態(tài)良好的MEF細(xì)胞;消化傳代過程;,如何去除MEF細(xì)胞;挑克隆的操作;,如何準(zhǔn)備用于進(jìn)行各種基因操作的細(xì)胞;如何準(zhǔn)備用于進(jìn)行注射的細(xì)胞;,,,,如何準(zhǔn)備狀態(tài)良好的MEF細(xì)胞;,取胚胎(135D)去除頭部和四肢;,剪碎后加入0125胰酶進(jìn)行消化到組織塊基本消失;,終止消化并離心收集細(xì)胞;(檢測細(xì)胞支原體)重懸接種500010000CELLS/CM2第二天換液后培養(yǎng)3天,進(jìn)行Γ射線照射;凍存檢測;,,,,生產(chǎn)過程控制,動物胚胎的孕齡;動物的污染物;細(xì)胞的支原體;,細(xì)胞的支持能力;細(xì)胞的失活;,蛋白表達(dá)檢測;,,,,合適的MEF的密度,細(xì)胞的貼壁效率;細(xì)胞的分泌能力;細(xì)胞的大??;,,,,最佳的密度受到很多因素影響25000CELLS,過密克隆生長緩慢,克隆小,但是立體感好;過稀克隆容易分化,邊緣不清晰,但是克隆增殖稍快;,最佳的密度克隆邊緣清晰,細(xì)胞容易增殖,大小均一。,,,,如何去除MEF,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)但是代數(shù)非常有限,基本不能長期傳代;,MEF培養(yǎng)可以長期培養(yǎng),細(xì)胞的狀態(tài)好,不,影響細(xì)胞的全能性;,原理利用不同細(xì)胞的貼壁的時(shí)間差異;,步驟消化后離心重懸,在包被明膠的皿上貼壁,30MIN,輕輕吸出上清,接入另外一個(gè)包被有,明膠的皿中30MIN,再吸出上清中的細(xì)胞;并在包被的皿上培養(yǎng)一段時(shí)間,就可以去除大部分的MEF細(xì)胞;,,,,影響因素,克隆的狀態(tài)分化的細(xì)胞的貼壁性會大大增加;,MEF的狀態(tài)MEF如果有大量的碎片也會增加,液體的粘稠度干擾細(xì)胞的正常分離;,消化的效果如果有MEF沒有和ES很好的分開,會將ES一起貼在皿上;,細(xì)胞團(tuán)和顆粒顆粒大細(xì)胞團(tuán)會導(dǎo)致細(xì)胞快速沉淀并導(dǎo)致細(xì)胞貼壁;,如果效果不佳可以進(jìn)行多次的重復(fù),但是會大大減少細(xì)胞的回收率;,,,,ES細(xì)胞的傳代,細(xì)胞的克隆出現(xiàn)足夠大,細(xì)胞的邊緣開始出現(xiàn)不清晰,細(xì)胞的克隆出現(xiàn)部分分化的情況;一般的周期是35天;,傳代比例依據(jù)細(xì)胞的克隆大小和細(xì)胞的生長狀態(tài),比例為15110;,消化的時(shí)候觀察一般以MEF為標(biāo)準(zhǔn),如果MEF基本上已經(jīng)開始脫壁就可以終止消化;,,,,,,,,,挑克隆技術(shù),當(dāng)克隆大部分出現(xiàn)分化的時(shí)候;克隆大小不均并且生長緩慢;注意事項(xiàng),拉針(要注意末端的大?。┗蚴褂?ML的注射器;,在體視鏡下操作,要在解剖超凈臺中操作;注意環(huán)境,避免污染;,提取的克隆要消化后才能進(jìn)行接種;單克隆的培養(yǎng)周期長,要更有耐心;,,,,用于ES囊胚注射的細(xì)胞控制,低代數(shù)(細(xì)胞的全能型和基因變異和染色體變異),低分化程度(細(xì)胞分化會大大影響細(xì)胞最后的整合的效率和生殖遺傳的比例),最低的控制標(biāo)準(zhǔn)正常的核型,細(xì)胞的各種分化蛋白沒有表達(dá),各種ES的正常表達(dá)蛋白正常;具有成瘤性;增殖速度快;無任何外源污染;,,,,其他類型的成體干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞,,,,,,間質(zhì)干細(xì)胞是目前研究最多的干細(xì)胞,來源研究方向不斷有文章報(bào)道從不同的組織分離出MSC,整體方向是有利臨床廣泛取材和減少病人痛苦;,與組織工程結(jié)合的研究方式,最重要是如何提高與組織的相容性和提高在向多個(gè)方向分化的控制,如何成為一個(gè)真正的組織;,臨床治療研究,也是目前細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn),國內(nèi)主要的治療細(xì)胞;,基因研究的載體,干細(xì)胞分化機(jī)制模型;,,,,CYAGEN能夠提供協(xié)助,來源研究基本上從體內(nèi)的各個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)非常多的干細(xì)胞,包括肌肉,肺部,肌腱,血管,皮膚等,而這些細(xì)胞都具有含量非常少,同時(shí)也具有非常明顯的組織特意性,表達(dá)非常多的組織特異性的蛋白;(提供高難度提取服務(wù)),組織材料學(xué)結(jié)合納米材料和其他生物學(xué)材料,用于研究具有臨床前景的材料;(細(xì)胞相容性,蛋白表達(dá),細(xì)胞分化分析等),臨床研究如何從單一來源獲得大量穩(wěn)定而且維持良好的生物學(xué)特性的細(xì)胞,同時(shí)保證生物的安全性;(提高全套的技術(shù)支持和服務(wù)),,,,間質(zhì)干細(xì)胞,定義來源于中胚層的早期細(xì)胞,能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞。,來源組織骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。,,,,分離方法,骨髓,人,猴子,犬,密度梯度離心法不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí),在一定離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。,大鼠,小鼠,兔子全骨髓貼壁法,脂肪等組織,人、大鼠、小鼠酶消化法,,,,,,,鑒定方法不同物種的表面標(biāo)記差異,表面標(biāo)志人,猴子大鼠小鼠,陽性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44,CD166,陰性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱陽CD34,CD45,,,,傳代能力,有限增殖,隨著傳代次數(shù)增加,分化能力逐漸降低,按照12的比例,人12代達(dá)到純化,最多1520代。,大鼠34代達(dá)到純化,最多2025代。,小鼠78代達(dá)到純化,最多2530代。,,,,間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的問題/解決方案,BMSCS來源長骨的骨髓,體內(nèi)與造血功能有緊密關(guān)系,,但是也存在牙髓和其他短骨里面,缺點(diǎn)是取材時(shí)給病人的痛苦較多;,ADSCS來源全身的脂肪組織,包括皮下和內(nèi)臟脂肪墊;,來源屬于微創(chuàng)方法取材,主要是來源于抽脂減肥的手術(shù);,其他來源的間質(zhì)干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、肌腱干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等;還有新生兒的臍帶、胎盤等其他組織;,,,,細(xì)胞形態(tài)不同的組織來源的間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)多樣,,基本無法從細(xì)胞的形態(tài)上進(jìn)行有效的區(qū)分;,表面抗原不同來源的細(xì)胞的表面標(biāo)記會有差異BMSC和ADSCS的區(qū)別就是CD106(/)和CD49D(,/);,分化能力會有較大的波動,隨著不同個(gè)體、不同組織,來源會有變化;,培養(yǎng)液選擇不同來源也是不同,,,,,間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征,P0,40X,P3,40X,,,,骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向分化為脂肪細(xì)胞,,,,,梭形、纖維樣細(xì)胞原代克隆樣生長傳代后勻質(zhì)、渦旋狀排列,HUMANDOG,RATMONKEY,MOUSERABBIT,,,,間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),標(biāo)準(zhǔn),1增殖速度變化;2細(xì)胞分化影響;3形態(tài)學(xué)變化;,4克隆形成率變化;5基因表達(dá)影響;,6使用的特殊要求;7價(jià)格因素;,,,,如何選擇間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇依據(jù)細(xì)胞的生長和要求參照文,章進(jìn)行優(yōu)化,需要添加部分的氨基酸或者糖;,血清篩選應(yīng)該利用10株以上的細(xì)胞,進(jìn)行克隆,形成率、生長曲線、分化能力的比較;,添加物營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、抗生素、細(xì)胞,因子添加;,優(yōu)選專業(yè)血清,普通胎牛血清,普通牛血,清,,,,,,細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題,細(xì)胞增殖速度下降間質(zhì)干細(xì)胞不是無限的細(xì)胞系,最佳的實(shí)驗(yàn)窗口是P3P8;,細(xì)胞老化培養(yǎng)環(huán)境不適合(包括培養(yǎng)的表面和培養(yǎng)液);胰酶對細(xì)胞表面蛋白的傷害;缺乏相關(guān)的生長因子;細(xì)胞本身端粒影響;,細(xì)胞分化血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體外培養(yǎng)時(shí)間影響;,,,,間質(zhì)干細(xì)胞常見的污染和控制,細(xì)胞污染、造血系統(tǒng)細(xì)胞;,取材來源污染病毒、或者其他感染;,支原體污染隱性污染,一般難以察覺,導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不斷下降,影響細(xì)胞正常增殖,擴(kuò)散和污染環(huán)境,影響最大;,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內(nèi),可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,,,,神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性,NESTIN陽性,自動聚集成球,球體的表面存在絨毛懸浮生長,無血清培養(yǎng),血清替代物,BFGF,EGF,,,,神經(jīng)干細(xì)胞,,,,NSC存在神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞,分化神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等,,,,NSC取材和培養(yǎng),鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)來源于145D胚胎的大腦GE區(qū);,,,大鼠神經(jīng)干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng),大鼠神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng),,,,使用CYAGEN神經(jīng)干分化試劑,使用血清誘導(dǎo),,,,NSC的操作要點(diǎn),傳代培養(yǎng),1、懸浮培養(yǎng)必須控制球的大小,傳代時(shí),自然沉降,去除其中大球;可以使用機(jī)械的方法;,2、懸浮法培養(yǎng)可以獲得大量的細(xì)胞;,3、貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞可以用于轉(zhuǎn)基因操作,,但是費(fèi)用很高;,4、整個(gè)培養(yǎng)過程必須保證無血清;5、保證細(xì)胞純度,獲得高擴(kuò)增率;,,,,干細(xì)胞的分化機(jī)理和相關(guān)的技術(shù)產(chǎn)品,,,,干細(xì)胞分化機(jī)理,WILDTYPE,MOUSE,FIBROBLASTS,MOUSE,FIBROBLASTS,CARRYING,MYF5BAC,,,,干細(xì)胞分化能力鑒定,分化試劑(檢測干細(xì)胞的尺)必須穩(wěn)定,否則結(jié),果波動非常大,將無法分析;,每次配置的分化試劑必須是有陽性對照進(jìn)行檢測,保證有分化誘導(dǎo)能力再用于檢測其他的細(xì)胞;不同的物種間最佳的誘導(dǎo)物濃度不同,所以不同物種間最好做一下濃度上面的優(yōu)化;,,,,,,,,,,干細(xì)胞分化的常見問題,分化比例影響因素;,細(xì)胞群分化能力整個(gè)細(xì)胞群體中干細(xì)胞的比率決定;代數(shù)細(xì)胞的分化比率隨代數(shù)增加下降;,誘導(dǎo)系統(tǒng)穩(wěn)定性誘導(dǎo)組方、藥物效價(jià)和配置過程影響;,,,,,,,分化時(shí)間影響因素,成骨24周成脂24周,成軟骨34周,不同物種人和大鼠容易誘導(dǎo),小鼠的需要更長時(shí)間,狗和兔子誘導(dǎo)時(shí)間波動大;,動物大小影響人和靈長類、狗等胚胎期或者新生代幼體分化率偏低;而成體的來源的MSC分化能力高,臍帶、臍血的MSC分化比例較低。,細(xì)胞質(zhì)量影響才是影響分化關(guān)鍵的核心,,,,分化的影響因素,不同的物種波動很大,不能橫向比較;,不同提取方法操作方法的差異,導(dǎo)致細(xì)胞群組成差異;,不同的培養(yǎng)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形態(tài)、大小、克隆的形態(tài)也不同,分化能力也有差異;使用A,MEM會降低干細(xì)胞的成脂肪分化;,不同代數(shù)分化也是會有波動,同時(shí)各個(gè)方向的分化變化的速度不同步;,,,,CYAGEN提供完善的分化系統(tǒng),骨、脂肪、軟骨分化囊括了多個(gè)物種、多種來源的干細(xì)胞的分化的試劑;穩(wěn)定高效干細(xì)胞的金指標(biāo);心肌分化、神經(jīng)分化,ORICELLTM提供定制的分化服務(wù);,,,,干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)解決方案,應(yīng)用的方向;,大動物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括靈長類等,需要的細(xì)胞量都是,108這個(gè)數(shù)量級以上;,多組動物的實(shí)驗(yàn)要獲得更加有說服力結(jié)果;大規(guī)模的篩選中藥成分篩選、藥物單體實(shí)驗(yàn);臨床使用干細(xì)胞干細(xì)胞的最終應(yīng)用;,ORICELLTM提供大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù),,,,ORICELLTM大規(guī)模培養(yǎng)的實(shí)現(xiàn),使用T175培養(yǎng)數(shù)量上可以直接增加,但是增加污染的風(fēng)險(xiǎn),系統(tǒng)不穩(wěn)定;,使用多層培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶;,使用小型細(xì)胞培養(yǎng)罐細(xì)胞擴(kuò)增容易但是收獲困難,條件控制不成,熟;,密閉的細(xì)胞工廠系統(tǒng)全密閉系統(tǒng),可以用增加數(shù)量方法放大規(guī)模,但是成本較高,需要環(huán)境控制系統(tǒng);,,,,,,,,,干細(xì)胞質(zhì)量控制和解決方案;,表面標(biāo)記與細(xì)胞分化,表面標(biāo)記有哪些核心標(biāo)記現(xiàn)在目前并未有一個(gè)非常特異得到公認(rèn)的表面抗原分子;,CYAGEN研究發(fā)現(xiàn),表面抗原分子和分化不具有,穩(wěn)定相關(guān)性;,表面抗原變化主要集中在前期和高代數(shù)時(shí)變化;分化能力的變化主要和代數(shù)有關(guān),和表面標(biāo)記有半相關(guān)性;,,,干細(xì)胞增殖能力指標(biāo);,生長曲線表現(xiàn)細(xì)胞自我更新能力的一個(gè)指標(biāo);克隆形成率表示具有較強(qiáng)自我更新能力的細(xì)胞,的比例的指標(biāo);,屬于和干細(xì)胞“SELFRENEW”相關(guān);,,,,,,,,,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞污染物控制,細(xì)胞污染物的控制和檢測方法;,細(xì)胞間污染不能不同細(xì)胞一起操作,使用相同的一瓶試劑;操作最好間隔1個(gè)小時(shí);,細(xì)菌污染所有使用的培養(yǎng)試劑進(jìn)行無菌檢測;,真菌污染嚴(yán)重影響細(xì)胞體內(nèi)試驗(yàn),一旦出現(xiàn)極難處理;內(nèi)毒素對所有使用的器械、容器、管道都進(jìn)行處理,,250度干烤或者是用堿洗;,外源異物污染避免使用玻璃操作,使用有認(rèn)證的產(chǎn)品,個(gè)人防護(hù);同時(shí)使用前對細(xì)胞懸液中進(jìn)行觀察,看是否有顆粒;,,,,大規(guī)模和有穩(wěn)定質(zhì)量控制的細(xì)胞的應(yīng)用,動物的體內(nèi)試驗(yàn)和解決方案,,,,干細(xì)胞的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),,,,,,,,干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用的注意事項(xiàng),凍存的細(xì)胞是否可以復(fù)蘇直接用于實(shí)驗(yàn);理論上是可行,但是對凍存液要求很高;復(fù)蘇率達(dá)到90以上,減低死亡細(xì)胞影響;,MSC類的細(xì)胞普通凍存液復(fù)蘇后細(xì)胞非常的脆,弱,最好經(jīng)過一次的培養(yǎng);,需要清洗去血清和DMSO(2511G/KG),同時(shí)降低內(nèi)毒素;,ORICELLTMNCR凍存液、DMSOFREE凍存液,,,,細(xì)胞自然成團(tuán)對體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的影響,導(dǎo)致血管內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞栓塞,直接導(dǎo)致動物急性死亡;,會在肺部、肝積聚,減低器臟功能,長期會有纖維化風(fēng)險(xiǎn);,細(xì)胞在懸浮的狀態(tài)下,會自然的聚集成松散團(tuán);死細(xì)胞多,釋放的DNA會導(dǎo)致細(xì)胞聚成大團(tuán);,1一小時(shí)內(nèi)使用,2細(xì)胞充分吹勻或者使用濾網(wǎng)200250目3培養(yǎng)過程中細(xì)胞絕對不能過密80最佳4細(xì)胞代數(shù)不能太高90,不影響干細(xì)胞的特性;細(xì)胞增殖不改變、細(xì)胞,分化不改變;,容易使用、穩(wěn)定性高,可以直接使用,無需任何的操作,凍存過程中細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定,無溫度波動,干細(xì)胞的凍存,凍存流程,1、選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照常用的方法收集細(xì)胞于試管中,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。,2、離心收集的細(xì)胞(參考離心條件4℃,250G,35分鐘),吸去上清液。,3、加入適當(dāng)?shù)膬龃嬉旱诫x心管,緩慢混合均勻,制成細(xì),胞混合液。細(xì)胞凍存濃度約為105~106CELLS/ML。,4、將離心管中的細(xì)胞混合液分裝至已做標(biāo)識的凍存管。5、將分裝好細(xì)胞的凍存管直接放于80℃冰箱,24H后可以移入196℃液氮中長期保存。,,,,干細(xì)胞的復(fù)蘇,復(fù)蘇流程,1、準(zhǔn)備好相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液,平衡至室溫;往離心管中加入68ML細(xì)胞培養(yǎng)液。準(zhǔn)備37℃水浴。,2、從80℃冰箱或液氮取出凍存的細(xì)胞,迅速放入37℃水浴中快速晃動,待凍存懸液完全溶解后,往凍存管中加入1ML細(xì)胞培養(yǎng)液,稍微吹打后立即將細(xì)胞混合液移入裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中,混合均勻。,3、離心收集的細(xì)胞(離心條件可參考細(xì)胞凍存方法),盡量移去上清液。,4、加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,按各自實(shí)驗(yàn)所需密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)器具中。,,,,我們的合作伙伴,非常感謝大家對我們的關(guān)注,
下載積分: 4 賞幣
上傳時(shí)間:2024-01-06
頁數(shù): 131
大?。?4.46(MB)
子文件數(shù):