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簡介：第二十五章免疫學(xué)診斷,教學(xué)要求1掌握凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的定義及其基本類型。2掌握間接免疫熒光法和ELISA的雙抗夾心法及間接法的基本操作步驟。3熟悉檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫的常用試驗(yàn)方法。4了解免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用。,第二十四章免疫學(xué)診斷,免疫學(xué)診斷即用免疫學(xué)方法確定疾病相關(guān)因子、監(jiān)測(cè)疾病過程、判斷療效及預(yù)后，涉及對(duì)疾病相關(guān)因子的診斷和輔助診斷，以及檢測(cè)機(jī)體免疫功能狀態(tài)。第一節(jié)抗原或抗體的檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)原理抗原的抗原決定基與抗體的結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)應(yīng)具有互補(bǔ)性，二者相互結(jié)合后，在適宜條件下，可出現(xiàn)可見反應(yīng)。,免疫學(xué)診斷,一、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)（一）抗原抗體反應(yīng)的特異性指一種抗原只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的專一性。它是免疫學(xué)診斷的重要基礎(chǔ)。1親和力AFFINITY抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合強(qiáng)度。2親合力AVIDITY一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度。3抗血清4一抗5二抗,免疫學(xué)診斷,（二）抗原抗體反應(yīng)的可見性抗原、抗體比例適合時(shí)，在適宜的鹽濃度下可形成肉眼可見的反應(yīng)物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗體反應(yīng)的可逆性抗原抗體之間的結(jié)合主要是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，穩(wěn)定，但在適當(dāng)條件（如低PH、高濃度鹽、凍融等）下可解離開，各自的生物學(xué)特性不發(fā)生改變。根據(jù)此特點(diǎn)，可利用親合層析法純化抗原或抗體。,,（五）影響抗原抗體反應(yīng)的因素P3791溫度適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子碰撞的機(jī)會(huì)，加快二者結(jié)合速度。不宜過高過低。2電解質(zhì)可使IC復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)。常用生理鹽水稀釋抗原或抗體。,免疫學(xué)診斷,3酸堿度最適PH6～8，否則可出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果4抗原和抗體性質(zhì)抗體的特異性和親和力是關(guān)鍵，初次應(yīng)答抗體親和力低，單克隆抗體親和力低；抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡等。,二抗原或抗體的檢測(cè)方法,根據(jù)抗原的性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為下列幾類（一）凝集反應(yīng)（AGGLUTINATIONP381細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在適宜電解質(zhì)下形成肉眼可見凝集物的反應(yīng)。,,1直接凝集玻片和試管凝集2間接凝集正相間接凝集和反向間接凝集。補(bǔ)充介紹3協(xié)同凝集以SPA為載體的反向間接凝集。在微生物檢測(cè)中常用。4間接凝集抑制試驗(yàn),,,抗原或抗體的檢測(cè)方法,（二）沉淀反應(yīng)（PRECIPITATIONP380血清蛋白質(zhì)、細(xì)菌裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的反應(yīng)。1單向免疫擴(kuò)散SINGLEIMMUNODIFFUSION（1）特點(diǎn)定性定量試驗(yàn)（2）用途可用于測(cè)定血清IGG,IGM,IGA和C3等的含量（3）原理沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)。（4）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,,,,,,,,,,2雙向免疫擴(kuò)散DOUBLEIMMUNODIFFUSION（1）特點(diǎn)定性半定量（2）用途用于抗原或抗體的定性檢測(cè)、組成和多抗原相關(guān)性分析。（3）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,3對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)（補(bǔ)充介紹）其實(shí)質(zhì)是將雙擴(kuò)與電泳相結(jié)合。（1）特點(diǎn)定性試驗(yàn)（2）用途主要用于病原微生物抗原的定性檢測(cè)。（3）操作鋪板打孔加樣電泳看結(jié)果。,,,,,,,,4免疫電泳（IMMUNOELECTROPHORESIS也是將電泳技術(shù)與雙向免疫擴(kuò)散結(jié)合的一種技術(shù)，先電泳后雙向免疫擴(kuò)散（見圖）。,,5免疫比濁（IMMUNOEPHELOMETRY）在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間形成IC，液體渾濁，用濁度計(jì)測(cè)反應(yīng)體系的濁度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中抗原含量。,,（四）免疫標(biāo)記技術(shù)P381用熒光素、酶、放射性核素等標(biāo)記抗原或抗體后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。提高檢測(cè)靈敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫熒光標(biāo)記技術(shù),1免疫熒光法可對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行鑒定和定位。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。用途可用于檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等的抗原或抗體，幫助診斷傳染病；也可用于鑒定免疫細(xì)胞的CD分子，檢測(cè)AID的抗核抗體等。,,（1）直接法缺點(diǎn)是每檢查一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）間接法敏感性比直接法高，制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢查，但非特異性增多。,,,,,,2酶免疫測(cè)定是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合。敏感度可達(dá)1UG/L,甚至1NG/L。常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）等。常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA）測(cè)定可溶性抗原或抗體，用酶免疫組化法測(cè)定,免疫酶標(biāo)記技術(shù),組織中或細(xì)胞表面的抗原。（1）ELISA①雙抗體夾心法用于檢測(cè)可溶性的特異性抗原。操作基本步驟用已知抗體包板洗滌封板洗滌加入待檢標(biāo)本洗滌加酶標(biāo)抗體洗滌加底物顯色結(jié)果觀察。,,,,,,,,,,免疫酶標(biāo)記技術(shù),②間接法檢測(cè)特異性抗體。非特異性增加?；静襟E用已知抗原包板加入待檢標(biāo)本加酶標(biāo)二抗加底物顯色觀察結(jié)果。,,,,,,,免疫標(biāo)記技術(shù),（2）酶免疫組化法將酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞表面的抗原反應(yīng)后，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查，對(duì)抗原進(jìn)行定性、定量、定位檢測(cè)。3放射免疫測(cè)定法用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，敏感度可達(dá)PG水平。常用于檢測(cè)微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、嗎啡、地高辛藥物和IGE等。,,4免疫印跡法P383又稱WESTERNBLOTTING，用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體后，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。常可檢測(cè)多種病毒的抗原或抗體。,第二節(jié)淋巴細(xì)胞的測(cè)定,淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，檢測(cè)其數(shù)量和功能是了解機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。一淋巴細(xì)胞的分離常用FICOLL（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心除去紅細(xì)胞、粒細(xì)胞而獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），再經(jīng)吸附除去單核細(xì)胞而得到淋巴細(xì)胞。若要分離T細(xì)胞，可用尼龍毛柱、抗CD3單抗、E花結(jié)試驗(yàn)等分離。,,,二、淋巴細(xì)胞的鑒定P386根據(jù)淋巴細(xì)胞的某些標(biāo)志，采用免疫熒光法、磁珠分離法、流式細(xì)胞術(shù)等方法可確定細(xì)胞的不同類型和比例。（一）T細(xì)胞功能測(cè)定1T細(xì)胞增殖試驗(yàn)植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（CONA）等絲裂原及抗CD3單抗等能非特異性激活培養(yǎng)的T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞的試驗(yàn)。,淋巴細(xì)胞功能測(cè)定,在該增殖過程中，細(xì)胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，細(xì)胞形態(tài)改變。也可檢測(cè)特異性抗原致敏的T細(xì)胞。（1）氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入法該法靈敏、可靠，應(yīng)用廣泛，但需特殊儀器（液體閃爍儀），易有放射性污染。（2）MTT法該法操作簡單，無放射性污染，但敏感性相對(duì)較差。,淋巴細(xì)胞功能測(cè)定,2細(xì)胞毒試驗(yàn)TC、NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細(xì)胞。（1）51CR釋放法用51CR標(biāo)記靶細(xì)胞，Γ記數(shù)儀測(cè)定釋放的51C活性。（2）MTT法其原理與增殖試驗(yàn)相同，但甲生成量與靶細(xì)胞溶解破壞水平呈負(fù)相關(guān)。,,3細(xì)胞因子檢測(cè)CK的檢測(cè)有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細(xì)胞，監(jiān)測(cè)某些疾病狀態(tài)的細(xì)胞免疫功能。常用的檢測(cè)方法有以下三種（1）ELISA法（2）生物活性測(cè)定法（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,淋巴細(xì)胞功能測(cè)定,4皮膚實(shí)驗(yàn)正常機(jī)體對(duì)某種抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫后，用相同抗原做皮膚試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)以局部紅腫為特征的DTH。細(xì)胞免疫正常時(shí)出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下則呈陰性反應(yīng)。該方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染（如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等）及免疫缺陷病等。,淋巴細(xì)胞功能測(cè)定,（二）B細(xì)胞功能測(cè)定P389B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，檢查B細(xì)胞的數(shù)量與功能是確定體液免疫是否正常的重要手段。1B細(xì)胞增殖試驗(yàn)2抗體形成細(xì)胞的測(cè)定吸附有特異性抗原的SRBC與抗體形成細(xì)胞分泌的IG特異性結(jié)合后活化補(bǔ)體，溶解SRBC。又稱溶血空斑試驗(yàn)。,,第四節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用（自學(xué)）,

簡介：西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE凋亡實(shí)驗(yàn)研究,麻發(fā)強(qiáng)黃勇攀貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院貴陽醫(yī)學(xué)院,西妥昔單抗CETUXIMAB是一種特異性針對(duì)EGFR的單克隆抗體，與EGFR結(jié)合可阻斷其自身受體相關(guān)激酶的活化與磷酸化以及有絲分裂信號(hào)的下傳，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長和誘導(dǎo)凋亡。,前言,2006年美國FDA批準(zhǔn)C225作為二線方案治療失敗的晚期頭頸部鱗癌。但對(duì)鼻咽癌治療中的作用還需要進(jìn)一步的探討。本實(shí)驗(yàn)主要研究西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株凋亡的效果和可能的機(jī)制。,前言,一、材料與方法,細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)48H，37℃恒溫，5％CO2,95％濕度環(huán)境中傳代培養(yǎng)。,試驗(yàn)分組細(xì)胞胞培養(yǎng)48H后隨機(jī)組；先加入工作濃度（10ΜG/ML）的西妥昔單抗05ΜL，48H后照射，放療12GY照射劑量。再行43℃熱療30MIN，后37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。,實(shí)驗(yàn)分組,HOCHEST33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡,將干凈無菌的蓋玻片置于30MM2培養(yǎng)皿，接種細(xì)胞過夜；當(dāng)50～80滿時(shí)，同前述處理；24H后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗兩遍；固定液固定后用HOCHEST332585MG/L染色；雙蒸水沖洗，封片；熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)拍照。,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CNE的凋亡率,取對(duì)數(shù)生長期的CNE細(xì)胞，每25CM2的培養(yǎng)瓶接種2106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行樣本，分別經(jīng)規(guī)定的處理因素處理后，消化收集細(xì)胞，用BINDING緩沖液400ΜL重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1106/ML；加入5ΜLANNEXINVFITC，混勻，4℃避光孵育15MIN；加入10ΜLPI染液（20ΜG/ML），4℃避光孵育5MIN后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，繼續(xù)培養(yǎng)24H和48H后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。,WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達(dá),加含PMSF裂解液冰上裂解30MIN提取蛋白，4℃12000RPM離心5MIN，取上清，蛋白定量后調(diào)整至濃度相同，95℃變性5MIN，8聚丙烯胺凝膠電泳2H，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5脫脂奶粉封閉1H。一抗（分別為1200稀釋的BAX、BCL2、ΒACTIN抗體4℃過夜，TBST洗膜3次（每次5MIN）。,WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達(dá),二抗1500稀釋羊抗鼠IGGAP室溫孵育1H，TBST洗膜3次（每次5MIN），AP顯色，運(yùn)用圖像分析儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，計(jì)算條帶的積分吸光度，以ACTIN水平作為等量蛋白上樣參照。BAX和BCL2蛋白的測(cè)定，每組重復(fù)四次，以均值代表測(cè)定結(jié)果。,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS160統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差MEAN±SD表示，兩組間比較采用配對(duì)資料T檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析STUDENTNEWMANKEULS檢驗(yàn)。P005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。,,二、結(jié)果,結(jié)果,1、熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（400）,A對(duì)照組B單純放療組,B,C放療熱療組,D放療西妥昔單抗,E放療熱療西妥昔單抗,2、ANNEXINV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果,聯(lián)合應(yīng)用ANNEXINVFITC和PI對(duì)培養(yǎng)體系中的細(xì)胞進(jìn)行染色，ANNEXINV/PI代表健康活細(xì)胞，ANNEXINV/PI代表早期凋亡細(xì)胞，ANNEXINV/PI代表晚期凋亡和壞死細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)處理后，主要觀察ANNEXINV/PI的早期凋亡細(xì)胞。,2、ANNEXINV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果,A對(duì)照組B單純放療組C放療熱療組,D放療西妥昔單抗組E放療熱療西妥昔單抗組,2、ANNEXINV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果,表示與對(duì)照組比較，P＜005；※表示與單放組、放熱組、放西組比較，P＜001；＊表示與24H比較，P＜005,表1西妥昔單抗聯(lián)合放療與熱療誘導(dǎo)CNE細(xì)胞凋亡效果分析,3、WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達(dá),為了檢測(cè)不同處理因素作用CNE后24H的BAX、BCL2蛋白表達(dá)情況與單放組、放療熱療組比較，放療西妥昔單抗和放熱西妥昔單抗聯(lián)合治療組BAX蛋白表達(dá)有差異（P＜005）；與單放、放療熱療放療西妥昔單抗比較，放熱西妥昔單抗聯(lián)合治療組下調(diào)BCL2蛋白表達(dá)作用顯著（P＜005）（圖3）,3、WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達(dá),,?ACTION（42KD）,BAX20KD,BCL2（26KD）,3、WESTERNBLOT分析BAX蛋白的表達(dá),,,表示放療西妥昔與單放組和放熱組比較，P＜005；表示綜合治療組與單放組、放熱組、放西組比較，P＜005，,3、WESTERNBLOT分析BCL2蛋白的表達(dá),,表示綜合治療組與單放組、放熱組、放西組比較，P＜005，,,三、討論,討論,腫瘤的分子靶向治療是當(dāng)今腫瘤研究中的熱點(diǎn)，其中EGFR在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在高表達(dá)和異常激活1。西妥昔單抗作為一種人鼠嵌合型抗體。與EGFR結(jié)合可抑制由內(nèi)源性配體引起的EGFR活化，細(xì)胞周期中G1停止，細(xì)胞增殖減少，凋亡增加，血管生成減少，侵襲力、轉(zhuǎn)移能力降低。,討論,CURRAND等報(bào)道單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合都取得了理想的抗腫瘤效果6，F(xiàn)ENGFY等報(bào)道證實(shí)單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合對(duì)頭頸部腫瘤細(xì)胞有放療增敏作用7。,討論,熱療是公認(rèn)的“綠色治療”，幾乎無副作用，是臨床上重要的輔助治療方法之一。近年來，通過與化放療聯(lián)合，熱療作為一種輔助的抗腫瘤手段日益受到人們重視。,討論,西妥昔單抗誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、擾亂腫瘤細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)，使細(xì)胞周期停滯在對(duì)放療相對(duì)敏感的G1期，而使對(duì)放療抗拒的S期細(xì)胞減少，從而增加細(xì)胞的放療敏感性9。熱療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡10，可抑制放療引起的亞致死損傷及潛在致死損傷的修復(fù)11；熱放療協(xié)同。,討論,本實(shí)驗(yàn)序顯示放療、放熱、放西妥昔單抗或放熱西妥昔單抗治療后可出現(xiàn)CNE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，引起凋亡，尤其靶放熱三者聯(lián)合形態(tài)學(xué)改變最為顯著；流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示聯(lián)合治療組的凋亡率均顯著高于單放、放熱、靶放組，表明三者在誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的過程中有較好的協(xié)同作用。,討論,在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中，采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)了促凋亡蛋白BAX和抑凋亡蛋白BCL2的表達(dá)。結(jié)果顯示各干預(yù)組BCL2蛋白表達(dá)均有不同程度的下降，這就說明放療、放療熱療、靶療放療及靶放熱療治療能夠抑制，但以靶放熱降低最為明顯。,討論,BAX促凋亡蛋白，在各干預(yù)組中，靶療放療及靶放熱中表達(dá)最為明顯，這說明靶療放療熱有協(xié)同促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。,結(jié)論,西妥昔單抗聯(lián)合放療及熱療在體外試驗(yàn)顯著增加鼻咽癌細(xì)胞株CNE的凋亡率，其機(jī)制可能與調(diào)控BAX、BCL2蛋白的表達(dá)促進(jìn)凋亡有關(guān)。,謝謝,

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簡介：第四篇實(shí)驗(yàn)診斷,血栓與止血檢測(cè)（2課時(shí)）長沙醫(yī)學(xué)院內(nèi)科教研室,課時(shí)安排2節(jié)教學(xué)課型理論課教學(xué)目的要求1掌握出血時(shí)間檢測(cè)的臨床意義及參考值。2了解血管壁、血小板、凝血因子、抗凝系統(tǒng)、纖維蛋白溶解系統(tǒng)在止血、凝血、纖溶的各種作用。,教學(xué)重點(diǎn)與教學(xué)難點(diǎn)◎重點(diǎn)血小板與凝血因子的檢測(cè)◎難點(diǎn)抗凝系統(tǒng)檢測(cè)與檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用教學(xué)方法、手段、媒介◎課堂講授◎穿插臨床實(shí)例及圖片◎多媒體教學(xué),血栓與止血檢測(cè),止血、凝血和纖溶機(jī)制血管壁檢測(cè)血小板檢測(cè)凝血因子檢測(cè)抗凝物質(zhì)檢測(cè)纖溶活性檢測(cè)檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,止血過程,,,,,凝血酶,,血流減慢,,,,,,,纖溶酶,止血、凝血和纖溶機(jī)制,血管壁的作用血小板的作用血小板的粘附血小板粘附于血管破損處VW因子VONWILLEBRANDFACTOR,VWF的作用,止血、凝血和纖溶機(jī)制,血小板的聚集與釋放,凝血因子的作用,凝血因子的作用外源性凝血途徑外源性凝血途徑凝血共同途徑,凝血活酶/凝血酶原酶,止血、凝血和纖溶機(jī)制,抗凝血系統(tǒng)的作用細(xì)胞抗凝作用單核吞噬系統(tǒng)與肝細(xì)胞體液抗凝作用抗凝血酶Ⅲ滅活ⅡⅨⅩⅪⅫ蛋白C系統(tǒng)滅活Ⅴ、ⅧPCAPCAPCPSⅡTMPS激活FLG,,,,,,止血、凝血和纖溶機(jī)制,抗凝血系統(tǒng)的作用體液抗凝作用組織因子途徑抑制物（TFPI）ⅩⅦ其他抗凝蛋白纖維蛋白溶解纖溶系統(tǒng)的作用,,血管壁檢測(cè)毛細(xì)血管抵抗力試驗(yàn),原理給毛細(xì)血管以負(fù)荷，檢查一定范圍內(nèi)新出現(xiàn)的出血點(diǎn)數(shù)目來估計(jì)血管壁完整性及其脆性。參考值5CM直徑圓內(nèi)男性7MIN為異常；出血時(shí)間測(cè)定器法69±21MIN，9MIN異常。DUKE法13MIN，4MIN為異常臨床意義血小板明顯減少，如原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少性紫癜；血小板功能異常，如血小板無力癥和巨大血小板綜合征；嚴(yán)重缺乏某些凝血因子，如VWD、DIC；血管異常，如遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；藥物干擾，如服用乙酰水楊酸、雙嘧達(dá)莫（潘生丁）等。,血管壁檢測(cè),血管性血友病因子抗原（VONWILLEBRANDFACTORANTIGEN，VWFAG）測(cè)定原理免疫火箭電泳法含VWF抗體的瓊脂凝膠板受檢血漿電泳，抗原抗體反應(yīng)形成的火箭樣沉淀線參考值941±3250。臨床意義減低VWD，是診斷VWD及其分型的指標(biāo)之一；增高血栓性疾病如心肌梗塞、心絞痛、腦血管病變、糖尿病、妊高征、腎小球疾病、大手術(shù)后等。,血小板檢測(cè)血小板計(jì)數(shù),采用鏡下目視法或自動(dòng)化血細(xì)胞分析儀。參考值（100300）109/L臨床意義減少①PC生成障礙再障、放射性損傷、急性白血病、巨幼細(xì)胞貧血、骨髓纖維化晚期等；②PC破壞或消耗ITP、SLE、淋巴瘤、上呼吸道感染、風(fēng)疹、DIC、TTP、血小板減少癥新生兒、輸血后、先天性；③PC分布異常脾腫大、血液被稀釋等。增多①原發(fā)性增多骨髓增生性疾?、诜磻?yīng)性增多急性感染、急性溶血、某些癌癥患者。,血小板檢測(cè),血小板粘附試驗(yàn)血小板聚集試驗(yàn)臨床意義增高血小板粘附、聚集功能增強(qiáng)，血小板被激活及其釋放反應(yīng)亢進(jìn)，見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如心肌梗塞、糖尿病、腦血管病變、深靜脈血栓形成、肺梗塞、口服避孕藥、晚期妊娠、高脂血癥、抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)、人工心臟和瓣膜移植術(shù)等。減低血小板無力癥、尿毒癥、肝硬化、骨髓增生性疾病、ITP、急性白血病、服用抗血小板藥物、低（無）纖維蛋白原血癥等。,血小板檢測(cè)血塊收縮試驗(yàn)（CRT）,參考值血塊收縮率4864臨床意義減低ITP、血小板增多癥、血小板無力癥、紅細(xì)胞增多癥、低（無）纖維蛋白原血癥、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥等。增高先天性和獲得性因子ⅫⅠ缺乏癥等。,血小板檢測(cè)血小板相關(guān)免疫球蛋白測(cè)定,原理ELISA包括PAIGG、PAIGA、PAIGM?？贵w與血小板相關(guān)抗原形成復(fù)合物加入酶標(biāo)抗體使底物顯色參考值PAIGG0788NG/107PLTPAIGA020NG/107PLTPAIGM070NG/107PLT,,臨床意義90ITPPAIGG增高，SLE等也為陽性激素治療的ITPPAIGG降低，復(fù)發(fā)時(shí)升高免疫性血小板減少性紫癜、惡性淋巴瘤、慢活肝、CLL、MM、EVAN綜合征等也增高。,凝血因子檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）,參考值3243秒，較對(duì)照延長10秒以上為異常。臨床意義延長①因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ明顯減少，如A、B型血友病、因子Ⅺ缺乏癥；②凝血酶原重度減少，如嚴(yán)重的肝損傷等；③纖維蛋白原嚴(yán)重減少，如纖維蛋白原缺乏癥、嚴(yán)重肝損傷等；④應(yīng)用肝素、口服抗凝藥時(shí)；⑤纖溶亢進(jìn)使纖維蛋白原降解增加時(shí)；⑥循環(huán)抗凝物質(zhì)增加，如類肝素物質(zhì)增多等?？s短高凝狀態(tài),凝血因子檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間（PT）,參考值PT1113秒超過正常對(duì)照值3秒以上為異常。PT比值（PTR）被檢PT/正常PT10±005國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）10土01臨床意義PT延長①先天性凝血因子I、Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅹ缺乏；②后天性凝血因子缺乏，如嚴(yán)重肝病、維生素K缺乏、纖溶亢進(jìn)、DIC、口服抗凝劑、異常凝血酶原增加等。PT縮短血液高凝狀態(tài)如DIC早期、心肌梗塞、腦血栓形成、DVT、多發(fā)性骨髓瘤等。INR是監(jiān)測(cè)口服抗凝劑的首選指標(biāo)，以INR為20～30為宜。,凝血因子檢測(cè)血漿纖維蛋白原測(cè)定,原理在受檢血漿中加人一定量凝血酶，后者使血漿中的纖維蛋白原（FIBRINOGEN，F(xiàn)G）轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，通過比濁原理計(jì)算FG的含量。參考值24G／L臨床意義增高糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、結(jié)締組織病、急性腎炎、灼傷、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)后、妊高征、急性感染、惡性腫瘤等以及血栓前狀態(tài)。減低DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化等。,凝血因子檢測(cè),血漿因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝活性測(cè)定臨床意義增高主要見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如DVT、肺栓塞、妊高征、晚期妊娠、口服避孕藥、腎病綜合征、惡性胂瘤等。減低FⅧ∶C減低見于血友病A、VWD、FⅧ抗體、DIC。FⅨ∶C減低見于血友病B、肝臟病、維生素K缺乏癥、DIC、口服抗凝藥物。FⅪ∶C減低見于因子Ⅺ缺乏癥、肝臟疾病、DIC等。FⅫ∶C減低見于先天性因子Ⅻ缺乏癥、肝臟疾病、DIC和某些血栓性疾病等。,凝血因子檢測(cè),血漿因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和X促凝活性測(cè)定臨床意義增高血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。減低相應(yīng)的先天性因子Ⅱ、V、Ⅶ和X缺乏癥，獲得性主要見于肝病、DIC、口服抗凝劑、維生素K缺乏癥等。,抗凝物質(zhì)檢測(cè)血漿抗凝血酶Ⅲ活性ATⅢA,參考值1085％±53％臨床意義增高見于血友病、白血病和再障等的急性出血期以及口服抗凝藥物治療過程中。減低見于先天性和獲得性ATⅢ缺乏癥，后者見于血栓前狀態(tài)、血栓性疾病、DIC和肝臟疾病等。,抗凝物質(zhì)檢測(cè)血漿蛋白C抗原PCAG,參考值1025％±201臨床意義減低先天性或獲得性PC缺乏癥，后者見于DIC、肝病、手術(shù)后、口服抗凝劑、急性呼吸窘迫綜合征。,纖溶活性檢測(cè)血漿硫酸魚精蛋白副凝固試驗(yàn)（PLASMAPROTAMINEPARACOAGULATIONTEST，3P試驗(yàn)）,原理受檢血漿中加入硫酸魚精蛋白溶液，如果血漿中存在可溶性纖維蛋白單體（SFM）與FDP的復(fù)合物時(shí)，則魚精蛋白使其解離釋出SFM，后者自行聚合成可見的纖維狀物，此為陽性反應(yīng)結(jié)果。結(jié)果陰性臨床意義陽性DIC的早、中期。陰性正常人、晚期DIC和原發(fā)性纖溶癥，也有假陰性。,纖溶活性檢測(cè)血漿凝血酶時(shí)間,原理受檢血漿中加人“標(biāo)準(zhǔn)化”凝血酶溶液，測(cè)定開始出現(xiàn)纖維蛋白絲所需的時(shí)間。參考值1618秒,較對(duì)照延長3秒以上為異常。臨床意義延長見于低（無）纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥；血中FDP增高（如DIC）；血中有肝素或類肝素物質(zhì)存在（如肝素治療中、SLE和肝臟疾病等）。,纖溶活性檢測(cè)血漿組織型纖溶酶原激活物活性（TPA）,參考值03～06U／ML臨床意義增高表明纖溶活性亢進(jìn)，見于原發(fā)性纖溶癥、繼發(fā)性纖溶癥如DIC等。減低表明纖溶活性減弱，見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，如動(dòng)脈血栓形成、DVT、高脂血癥、口服避孕藥、缺血性中風(fēng)等。,纖溶活性檢測(cè)血漿纖維蛋白/原降解產(chǎn)物FDP,原理膠乳凝集法受檢血漿加入FDP抗體包被的膠乳顆粒懸液，血液中FDP與膠乳顆粒上的抗體結(jié)合發(fā)生凝集。根據(jù)受檢血漿的稀釋度可計(jì)算出血漿FDP的含量。參考值5MG/L臨床意義增高見于原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病、肺梗塞、DVT、腎臟疾病、肝臟疾病、器官移植的排斥反應(yīng)、溶栓治療等。,纖溶活性檢測(cè)血漿D二聚體（DDIMER，DD）,方法膠乳凝集法ELISA法參考值膠乳凝集法為陰性；ELISA法200ΜG/L臨床意義繼發(fā)性纖溶癥（如DIC）為陽性或增高；原發(fā)性纖溶癥為陰性或不升高；兩者鑒別的重要指標(biāo)。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,篩選試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用一期止血缺陷BT和PC都正常過敏、單純性和其他血管性紫癜等。BT↑，PC↓原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少性紫癜。BT↑，PC↑原發(fā)性或繼發(fā)性血小板增多癥。BT↑，PC正常血小板無力癥、貯藏池病以及低（無）纖維蛋白原血癥、血管性血友?。╒WD）等。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,二期止血缺陷APTT和PT正常遺傳性和獲得性因子ⅫⅠ缺乏癥。獲得性因子ⅫⅠ缺乏癥常由嚴(yán)重肝病、肝臟腫瘤、惡性淋巴瘤、白血病、因子ⅫⅠ抗體、AIHA和惡性貧血等。APTT↑，PT正常血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺乏癥、血循環(huán)中有凝血因子（如因子Ⅷ）抗體存在；DIC時(shí)可見因子Ⅷ、因子Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ減低；肝臟疾病時(shí)可見因子Ⅸ、Ⅺ和XLL減少。APTT正常，PT↑遺傳性和獲得性因子Ⅶ缺乏癥。APTT和PT↑遺傳性和獲得性因子X、Ⅴ、凝血酶原和纖維蛋白原缺乏癥。用肝素治療時(shí)，APTT也相應(yīng)延長；應(yīng)用口服抗凝劑治療時(shí)，PT也相應(yīng)延長。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,篩選試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用纖溶活性亢進(jìn)性出血FDP和DD均正常表示纖溶活性正常。FDP陽性，DD陰性理論上只見于纖維蛋白原被降解，而纖維蛋白未被降解，即原發(fā)性纖溶。FDP陰性，DD陽性理論上只見于纖維蛋白被降解，而纖維蛋白原未被降解，即繼發(fā)性纖溶。FDP和DD都陽性表示纖維蛋白原和纖維蛋白同時(shí)被降解，見于繼發(fā)性纖溶，如DIC和溶栓治療。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,出血性疾病診斷試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用血小板功能異常性疾病分子缺陷分子檢測(cè)功能檢測(cè)粘附、聚集試驗(yàn)，ΒTG、PF4等血友病類出血性疾病APTT，血漿因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ促凝活性測(cè)定，STGT，VWFAG等,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,DIC診斷試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用臨床診斷存在易致DIC的基礎(chǔ)疾病一般診斷試驗(yàn)同時(shí)有下列3項(xiàng)以上試驗(yàn)異常血小板進(jìn)行性下降。FG進(jìn)行性減低，低于15G/L或增高超過4G/L。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,DIC診斷試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用一般診斷試驗(yàn)3P試驗(yàn)陽性或血漿FDP超過20MG/L，或DD水平較正常對(duì)照值增高4倍以上（陽性）。PT延長或縮短3S以上（肝?。?S）；APTT延長10S以上或縮短5S以上。ATⅢ活性低于60（不適用于肝?。┗虻鞍證活性減低。血漿因子ⅧC低于50（肝病必備）。,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,抗凝和溶栓治療實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用普通肝素UFH首選APTT作為監(jiān)測(cè)試驗(yàn)，使APTT測(cè)定值維持在正常對(duì)照值的1525倍；血小板計(jì)數(shù)低于50109/L需暫時(shí)停藥。低分子量肝素LMWH較大劑量LMWH也需監(jiān)測(cè)?？蛇x用因子XA抑制試驗(yàn)（抗因子XA活性測(cè)定），使其維持在0205AFXAIU/ML。血小板計(jì)數(shù)低于50109/L需暫時(shí)停藥。血漿ATⅢ活性ATⅢ∶A測(cè)定維持在80120％,檢測(cè)項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,抗凝和溶栓治療實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)試驗(yàn)的選擇和應(yīng)用口服抗凝劑的監(jiān)測(cè)選用血漿凝血酶原時(shí)間比率PTR，使其維持在1520為佳。WHO推薦INR作為首選口服抗凝劑的監(jiān)測(cè)試驗(yàn)，維持在2030之間。溶栓治療的監(jiān)測(cè)用FG、TT和FDP作為出血監(jiān)測(cè)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。抗血小板治療的監(jiān)測(cè)①BT；②PLT；③血小板聚集試驗(yàn)。降纖藥的監(jiān)測(cè)①FG測(cè)定；②PLT。,

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