新型DNA折紙芯片系統(tǒng)的開發(fā)與研究.pdf

1、DNA納米技術(shù)是一門新興的交叉學科，是指利用DNA自組裝構(gòu)建各種一維、二維、或三維的結(jié)構(gòu)，并開發(fā)其應用。DNA納米技術(shù)從80年代中期Seeman開創(chuàng)至今，已經(jīng)經(jīng)歷了長足發(fā)展。國內(nèi)目前系統(tǒng)介紹該領(lǐng)域的論文或?qū)Ｖ鴺O少，所以本論文的目的之一就是對其研究進展做出最新最全的綜述，希望能對國內(nèi)的研究者有所幫助，推動該領(lǐng)域在國內(nèi)的發(fā)展。因為是交叉學科，論文涉及到生物、化學、物理、數(shù)學、計算機、納米技術(shù)等知識內(nèi)容，相信任何相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者都可以在此

2、找到用武之地。
　　 DNA納米技術(shù)包括tile自組裝、DNA折紙術(shù)、及DNA納米器件三個大的方向，本文受篇幅所限只涉及前兩個分支。除此之外，本文還分析了DNA參與納米技術(shù)領(lǐng)域的種種優(yōu)勢，并詳述了DNA納米技術(shù)的一項重要應用-DNA納米排布。
　　 本課題的內(nèi)容是開發(fā)一種新型的DNA折紙芯片，這其實也屬于納米排布的一種。所謂DNA折紙芯片，就是由DNA折紙術(shù)得到的圖形改造為的芯片。2008年初，美國亞利桑那大學的Ke等研

3、制出了第一張、也是此前唯一一張折紙芯片。他們把折紙圖形上的訂書釘鏈伸出V字型探針，然后與溶液中的目標RNA雜交，通過雜交前后AFM圖像的亮度差實現(xiàn)檢測。該芯片的優(yōu)點是目標鏈不用標記，檢測較靈敏，但缺點是存在位置效應（折紙圖形各位置的探針雜交效率有明顯差異），且可擴展性不強。我們的目的就是用新的策略制成折紙芯片，希望在盡量保持Ke等原有優(yōu)點的同時，改善其不足。
　　 我們的核心思路是把V字型探針改為最常用的“一字型”探針，并引入b

4、iotin-STV反應來增強信號強度。具體的做法是在折紙圖形特定位置的訂書釘鏈末端伸出寡核苷酸探針，讓它與末端修飾biotin的目標鏈一對一雜交，雜交后加入STV蛋白使得雜交位點在AFM下呈現(xiàn)明顯亮點，從而實現(xiàn)檢測。另外我們還把Ke等的折紙矩形換為折紙術(shù)中國地圖，這是為了增加探針的可尋址性。
　　 我們先用預實驗驗證了biotin-STV反應的可行性，然后在正式試驗中用8個探針對一個32-mer目標鏈檢測，從AFM的圖上可以看出

5、，亮點非常特異，效率較高，與設(shè)計完全相同。實驗的成功證明了方案的可行，接下來，我們就著手考察本折紙芯片的特性，特別是Ke等芯片中的不足之處。
　　 我們共分析了兩種效應的影響：位置效應和biotin方向效應。我們先把上面使用過的8個探針分為兩組，一組位于圖形邊界，一組位于中央，然后觀察兩組的檢測效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組并無差異，這說明本芯片無位置效應。我們又把同樣的8個探針分為另外兩組，一組是訂書釘鏈3’端延伸探針，此時雜交后biot

6、in將朝下，另一組5’延伸，雜交后biotin朝上，也觀察兩組效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3’組比5’組效率高，我們推測主要是3’的成像效果更好，于是以后都推薦用3’延伸。
　　 我們還進一步設(shè)計了兩個更深入的實驗。第一個是多重檢測，即考察一張芯片同時對多個目標鏈檢測的分辨能力。我們同時在地圖的兩個位置分別伸出一列32-mer和一列20-mer的探針，然后分別加入對應的目標鏈，觀察圖形是否在特異的位置產(chǎn)生亮點。結(jié)果顯示特異性很好。第二個是夾心

7、法實驗，這是一種新的雜交策略，即用capture probe來固定目標鏈，用reporter probe來釋放雜交信號。這種設(shè)計的好處要么是折紙芯片本身的通用性，要么是目標鏈的label-free性，取決于capture探針是否設(shè)計為通用。
　　 除此之外，我們還做了若干延伸實驗。對納米金和量子點的排布有一些好的結(jié)果，但仍需進一步驗證；修飾i-motif的實驗則沒有很好的證據(jù)顯示分子馬達的工作狀態(tài)。這里特別要說的是利用本折紙芯片

8、對SNP的檢測，我們又設(shè)計了一種雜交方式，引入了toehold的鏈競爭機制，目前已實現(xiàn)對兩個連續(xù)堿基差異的檢測。進一步的優(yōu)化實驗仍在進行中，本系統(tǒng)有望實現(xiàn)完全label-free、且可重用的折紙芯片。
　　 總之，本研究開發(fā)了一種新型的DNA折紙芯片，它與之前已有的折紙芯片相比，不用做索引標記、沒有位置效應、具備很強的擴展?jié)摿Α１狙芯坎粌H對本折紙芯片的特性做了較系統(tǒng)的考察，還設(shè)計了另外兩種非常有意義的雜交方式，大大推動了本折紙芯

9、片向?qū)嵱妙I(lǐng)域的發(fā)展。
　　 本文第三章對DNA納米技術(shù)將來的幾個發(fā)展方向做了展望，分別提出了自組裝構(gòu)圖、功能化納米排布、內(nèi)在機制、實用性四個分支所可能取得突破的一些研究課題。
　　 本文最后還以附章的形式介紹了本人在研究生階段所進行的另一項工作：關(guān)聯(lián)分析。研究集中在G72與COMT兩個基因與雙相情感障礙(BP)疾病的關(guān)聯(lián)上，最后分別在兩個基因中各找到一個與BP呈陽性關(guān)聯(lián)的SNP，rs778293和rs4680，暗示了兩個