基于空化效應(yīng)的通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的：由病原微生物引起的食品安全事件、突發(fā)傳染病疫情和生物恐怖襲擊總是層出不窮、接連不斷、此起彼伏，不僅危害個(gè)人健康和生命安全，而且還容易造成社會(huì)恐慌和騷亂。一旦遇到此類可疑情況，如果僅僅依托傳統(tǒng)生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)可疑微生物樣本進(jìn)行檢測(cè)，從現(xiàn)場(chǎng)采集到樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、分離培養(yǎng)、核酸提取和檢測(cè)鑒定，整個(gè)流程下來通常需要2~4天才能確定可疑樣本，這顯然滿足不了現(xiàn)場(chǎng)快速應(yīng)急處置的需求。為了提高事發(fā)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急處置的速度和效率，需要對(duì)微生物進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和鑒定，通

2、常是采用RT-PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)——因?yàn)榛赗T-PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)特異性好、靈敏度高，已經(jīng)成為微生物檢測(cè)鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
　　目前已經(jīng)存在便攜式RT-PCR儀可以攜至事發(fā)現(xiàn)場(chǎng)使用，然而對(duì)于微生物樣本核酸的制備，仍是由操作人員手工完成，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低下、一致性差，而且存在極高的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有的核酸自動(dòng)制備儀，僅實(shí)現(xiàn)了核酸制備過程的“自動(dòng)化”和“標(biāo)準(zhǔn)化”，雖然提高了效率和準(zhǔn)確性，但是沒有解決“通用性”和“封閉性”的問題

3、，無法應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)核酸制備中。
　　基于以上背景，本課題開展通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，為開發(fā)同時(shí)滿足“自動(dòng)化”、“標(biāo)準(zhǔn)化”、“通用化”和“封閉化”的核酸制備系統(tǒng)提供理論支撐和解決方案。
　　方法與內(nèi)容：本課題開展通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，主要從超聲空化裂解細(xì)胞的機(jī)理研究、非接觸式超聲波微生物樣本細(xì)胞裂解的方案設(shè)計(jì)和建模分析、多模聯(lián)振增強(qiáng)理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)、封

4、閉式核酸分離純化標(biāo)準(zhǔn)化方案的建立和優(yōu)化、通用型封閉式核酸自動(dòng)制備平臺(tái)的設(shè)計(jì)與研制等5個(gè)部分展開，分別采用的技術(shù)路線和方法是“現(xiàn)象觀察—文獻(xiàn)調(diào)研—流場(chǎng)建模—裂解建?！獏?shù)計(jì)算”、“現(xiàn)狀分析—方案設(shè)計(jì)—建模分析—解析計(jì)算—數(shù)值計(jì)算”、“理論提出—理論論證—參數(shù)優(yōu)化—平臺(tái)搭建—實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)”、“現(xiàn)狀分析—方案設(shè)計(jì)—體系優(yōu)化—平臺(tái)搭建—實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)”、“方案設(shè)計(jì)—結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)—平臺(tái)設(shè)計(jì)—樣機(jī)試制—實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)”。具體內(nèi)容如下：
　?。?）超聲空化裂解細(xì)胞

5、的機(jī)理研究
　　通過現(xiàn)象觀察和文獻(xiàn)調(diào)研，分析超聲空化效應(yīng)能夠裂解細(xì)胞的因素來源；然后建立超聲空化中的流場(chǎng)模型，并對(duì)其運(yùn)動(dòng)規(guī)律進(jìn)行描述；參照流場(chǎng)中液滴發(fā)生破裂的機(jī)理，建立超聲空化流場(chǎng)中細(xì)胞發(fā)生裂解的動(dòng)力學(xué)方程，并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。
　?。?）非接觸式超聲波微生物樣本細(xì)胞裂解的方案設(shè)計(jì)和建模分析
　　鑒于現(xiàn)有接觸式超聲波裂解儀存在的諸多缺陷和不足，設(shè)計(jì)一種非接觸式超聲波微生物樣本細(xì)胞裂解的方案；為研究核心問題，建立非接觸

6、式超聲波裂解方案的簡(jiǎn)化模型；根據(jù)彈性體振動(dòng)的基本理論和方程，計(jì)算傳振膜模態(tài)參數(shù)的解析解；然后，基于有限元分析，計(jì)算傳振膜模態(tài)參數(shù)的數(shù)值解。
　?。?）多模聯(lián)振增強(qiáng)理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)
　　根據(jù)示例傳振膜前十階模態(tài)固有頻率分布的規(guī)律，提出并論證多模聯(lián)振增強(qiáng)理論；為保證最佳的能量傳遞效率，討論并確定傳振膜工作的臺(tái)階次序和模態(tài)階數(shù)；探索曲率半徑、厚度和耦合力對(duì)傳振膜第二臺(tái)階頻率的影響，并對(duì)各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)；然后搭建裂

7、解實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，開展微生物樣本細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)、裂解率和核酸檢測(cè)三個(gè)方面對(duì)所設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。
　?。?）封閉式核酸分離純化標(biāo)準(zhǔn)化方案的建立和優(yōu)化
　　鑒于現(xiàn)有的核酸分離純化方法不能移植到現(xiàn)場(chǎng)核酸自動(dòng)制備中，設(shè)計(jì)一種增壓過濾式核酸分離純化方案；然后，對(duì)分離純化體系進(jìn)行構(gòu)建和優(yōu)化；根據(jù)設(shè)計(jì)的方案和優(yōu)化的體系，開展微生物核酸分離純化實(shí)驗(yàn)，通過 PCR擴(kuò)增和凝膠電泳對(duì)所設(shè)計(jì)的方案和優(yōu)化的體系進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。
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8、5）通用型封閉式核酸自動(dòng)制備平臺(tái)的設(shè)計(jì)與研制
　　基于非接觸式超聲波裂解方案和封閉式核酸分離純化方案，設(shè)計(jì)通用型封閉式微生物樣本核酸制備的原理方案，并對(duì)處理盒的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)；為了實(shí)現(xiàn)處理盒自動(dòng)化的功能，設(shè)計(jì)通用型封閉式核酸自動(dòng)制備平臺(tái)，具體包括機(jī)械模塊、電路模塊和控制模塊的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)；然后，試制四通道樣機(jī)，開展微生物核酸自動(dòng)制備實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞濃縮富集效率、核酸產(chǎn)量和質(zhì)量、核酸制備一致性（重復(fù)性）、核酸可檢測(cè)性共四個(gè)維度對(duì)四通道樣

9、機(jī)進(jìn)行性能評(píng)測(cè)。
　　結(jié)果：按照既定的技術(shù)路線和方法，對(duì)通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備課題中的各個(gè)部分進(jìn)行研究，均獲得了預(yù)期成果。
　?。?）超聲空化裂解細(xì)胞的機(jī)理研究
　　通過現(xiàn)象觀察和文獻(xiàn)調(diào)研，確定了超聲空化能夠裂解細(xì)胞的因素來源是機(jī)械力的作用；建立了超聲空化中的流場(chǎng)模型——含渦流場(chǎng)模型，描述了超聲空化流場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)規(guī)律；建立了細(xì)胞發(fā)生裂解的動(dòng)力學(xué)條件，并分別推導(dǎo)了大尺度渦流和小尺度渦流在細(xì)胞周圍產(chǎn)生的動(dòng)壓差的

10、數(shù)學(xué)表達(dá)式；根據(jù)細(xì)胞發(fā)生裂解的臨界條件，推導(dǎo)了超聲空化場(chǎng)中細(xì)胞最大穩(wěn)態(tài)尺寸的理論公式；根據(jù)細(xì)胞尺度分布函數(shù)，推導(dǎo)了細(xì)胞裂解率的理論表達(dá)式。
　　（2）非接觸式超聲波微生物樣本細(xì)胞裂解的方案設(shè)計(jì)和建模分析
　　設(shè)計(jì)的非接觸式超聲波微生物樣本細(xì)胞裂解方案，克服了現(xiàn)有接觸式超聲波裂解儀存在的諸多缺陷；建立了非接觸式超聲波裂解的簡(jiǎn)化模型，分析了核心和“瓶頸”問題；根據(jù)彈性體振動(dòng)的基本理論，獲得了傳振膜固有頻率和固有振型的解析解；基于

11、ANSYS模態(tài)分析，獲得了特定參數(shù)（寬度W=12 mm、曲率半徑R=22 mm、厚度T=0.4 mm、受超聲波探頭的耦合力F=3 N）傳振膜前十階模態(tài)固有頻率和固有振型的數(shù)值解。
　?。?）多模聯(lián)振增強(qiáng)理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)
　　提出并論證了多模聯(lián)振增強(qiáng)理論，為后續(xù)優(yōu)化傳振膜提供了指導(dǎo)思想和基本原則；確定傳振膜應(yīng)該工作在第二臺(tái)階頻率上，此時(shí)三階模態(tài)（M3）、四階模態(tài)（M4）、五階模態(tài)（M5）和六階模態(tài)（M6）發(fā)生多

12、模聯(lián)振；分別研究了曲率半徑、厚度和耦合力對(duì)傳振膜第二臺(tái)階頻率的影響，發(fā)現(xiàn)G2臺(tái)階頻率隨著曲率半徑的增加而緩慢減小，隨著厚度的增加而快速增加（線性），隨著耦合力的增加而緩慢減?。ň€性），并對(duì)各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)；根據(jù)優(yōu)化的參數(shù)，搭建了細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，開展微生物樣本細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)、裂解率和核酸檢測(cè)三個(gè)方面證明了所設(shè)計(jì)的非接觸式超聲波裂解方案能有效裂解不同類型的微生物樣本細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)核酸的釋放，具有良好的通用性。
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13、）封閉式核酸分離純化標(biāo)準(zhǔn)化方案的建立和優(yōu)化
　　設(shè)計(jì)的增壓過濾式核酸分離純化方案，滿足核酸分離純化過程對(duì)封閉化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、通用性和連貫性的要求；綜合考慮核酸產(chǎn)量和質(zhì)量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)，優(yōu)化了分離純化體系，核酸吸附載應(yīng)當(dāng)選擇粒徑為1μm的Affimag SLE系列磁性微球，結(jié)合液中NaCl濃度應(yīng)控制在4~5 mol/L，pH值控制在3~4范圍內(nèi)；根據(jù)優(yōu)化的體系，使用增壓過濾式核酸分離純化方案的簡(jiǎn)易過濾裝置，對(duì)裂解后的大腸桿菌、金黃色葡

14、萄球菌和萎縮芽孢桿菌進(jìn)行核酸提取，然后通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳進(jìn)行效果評(píng)測(cè)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的增壓過濾式核酸分離純化方案能夠?qū)崿F(xiàn)微生物樣本核酸的分離和純化。
　?。?）通用型封閉式核酸自動(dòng)制備平臺(tái)的設(shè)計(jì)與研制
　　設(shè)計(jì)了通用型封閉式核酸自動(dòng)制備平臺(tái)，并完成四通道樣機(jī)的試制，開展微生物核酸自動(dòng)制備實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃縮富集效率方面，微孔濾膜截留率超過90％，處理盒最大濃縮倍數(shù)為59.31倍；在核酸質(zhì)量（純度）方面，四通

15、道樣機(jī)制備的核酸純度略低于天根公司 TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒手工制備的核酸，但OD260/280均超過1.6，說明核酸純度較高，可以用于下游檢測(cè)分析；在核酸產(chǎn)量（濃度）方面，四通道樣機(jī)在革蘭氏陰性細(xì)菌核酸制備中的表現(xiàn)不如TIANamp試劑盒，但是在革蘭氏陽性細(xì)菌和細(xì)菌芽孢核酸制備中的表現(xiàn)均優(yōu)于TIANamp試劑盒，說明四通道樣機(jī)具有比較優(yōu)良的細(xì)胞裂解能力，但是在核酸分離純化體系上仍需進(jìn)一步優(yōu)化；在核酸制備一

16、致性方面，四個(gè)通道在6次核酸制備中的核酸產(chǎn)量變異系數(shù)分別為5.02%、4.96%、4.74%和5.73%，通道間的核酸產(chǎn)量平均（6次重復(fù)）變異系數(shù)為5.55%，樣機(jī)整體變異系數(shù)為5.66%，而TIANamp試劑盒6次試驗(yàn)的變異系數(shù)高達(dá)17.14%，說明四通道樣機(jī)在核酸制備中具有良好的一致性（重復(fù)性）；在核酸可檢測(cè)性方面，四通道樣機(jī)制備的核酸能夠直接用于 RT-PCR檢測(cè)，理論上最低檢出限為43 cfu/mL。
　　結(jié)論：本課題了開

17、展了通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，設(shè)計(jì)了通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備的系列解決方案，研制了滿足“自動(dòng)化”、“標(biāo)準(zhǔn)化”、“通用化”和“封閉化”要求的四通道通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)制備樣機(jī)，并通過實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞濃縮富集效率、核酸產(chǎn)量和質(zhì)量、核酸制備一致性（重復(fù)性）、核酸可檢測(cè)性等多個(gè)維度進(jìn)行了性能評(píng)測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明研制的四通道樣機(jī)能夠用于多種類型微生物樣本的核酸自動(dòng)制備，不僅濃縮富集效率高，而且制備的