Xcc8004中XC0872、XC0979、XC0976、XC1973、XC1974的缺失突變體的表型分析.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)是全球十字花科植物黑腐病的病原菌。Xcc不但是一種重要的植物病原菌，它還因能夠生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值高的胞外多糖(extracellularpolysaccharide，EPS)，又稱黃原膠，而為人們熟知。糖代謝對(duì)于Xcc的致病性和EPS合成都至關(guān)重要?；蚪M注釋表明Xcc8004擁有EDP(Entner-Doudoroffpathway)、EMP(E

2、mbdenMeyerhofpathway)、PPP(pentosephosphatepathway)和糖異生途徑等多條糖代謝途徑所需的基因，其中有些基因已經(jīng)得到較為深入的闡述。根據(jù)Xcc8004基因組的注釋，XC0872、XC0979和XC0976被預(yù)測(cè)為EMP途徑中的基因，分別編碼6-磷酸果糖激酶、1，6-二磷酸果糖醛縮酶和磷酸甘油酸激酶；XC1974和XC1973被注釋為EDP中的兩個(gè)重要基因，分別編碼6-磷酸葡萄糖酸脫水酶和2-酮

3、-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶。本工作以同源雙交換的方法構(gòu)建了上述基因的缺失突變體，分別命名為DM0872、DM0979、DM0976、DM1974和DM1973，并對(duì)這些突變體進(jìn)行表型檢測(cè)。在以葡萄糖或果糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，DM0872形成的菌落大小跟野生型相似。以含葡萄糖、果糖、半乳糖或甘油的NY培養(yǎng)基進(jìn)行EPS產(chǎn)量定性檢測(cè)，結(jié)果表明XC0872缺失后不影響EPS合成。在寄主蘿卜中進(jìn)行致病性檢測(cè)，結(jié)果顯示XC087

4、2缺失后并不影響其致病性。XC0872被注釋為6-磷酸果糖激酶，但是有文獻(xiàn)報(bào)道在Xcc中沒(méi)有檢測(cè)出6-磷酸果糖激酶活性。本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR的方法對(duì)XC0872進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示XC0872在Xcc中是轉(zhuǎn)錄的，說(shuō)明6-磷酸果糖激酶失活的原因不發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在以葡萄糖或果糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中，DM0976、DM1974和DM1973都無(wú)法維持生長(zhǎng)，但是DM0872和DM0979仍然生長(zhǎng)。該結(jié)果表明XC0976、XC197

5、4和XC1973為葡萄糖和果糖代謝所必需。在所檢測(cè)的C3或C4化合物為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中DM0976和DM0979均無(wú)法生長(zhǎng)，其互補(bǔ)菌與野生型菌株能夠生長(zhǎng)，表明XC0976和XC0979都是糖異生途徑所必需的。在葡萄糖或者丙酮酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中，DM0976都無(wú)法生長(zhǎng)；然而在葡萄糖和丙酮酸混合的基本培養(yǎng)基中，DM0976能夠生長(zhǎng)。我們認(rèn)為該結(jié)果能夠很好地解釋為何在豐富培養(yǎng)基中DM0976和其它突變體都能較好地生長(zhǎng)。在半乳糖為

6、唯一碳源的固體基本培養(yǎng)基中，DM0979和DM0976的菌落都明顯變小，而其互補(bǔ)菌的菌落大小能恢復(fù)與野生型的程度。這表明XC0976和XC0979與半乳糖的利用相關(guān)。在葡萄糖或果糖培養(yǎng)基中，DM1974和DM1973的EPS合成產(chǎn)量下降了60％左右。我們推測(cè)XC1974和XC1973突變后，EDP途徑受阻，Xcc無(wú)法獲得足夠的能量供給EPS合成，因此產(chǎn)量下降。XC0976也是完整的EDP途徑所需要的，但它的突變體DM0976在利用葡萄糖

7、和果糖生產(chǎn)EPS的產(chǎn)量與野生型相比沒(méi)有明顯變化。我們推測(cè)這與DM0976能在多種碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好有關(guān)。在以半乳糖平板定性檢測(cè)突變體的EPS產(chǎn)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)DM0979形成的菌落明顯比野生型菌落小，其互補(bǔ)菌能恢復(fù)野生型的水平，表明XC0979與在半乳糖培養(yǎng)基中的EPS合成相關(guān)。在宿主滿身紅蘿卜中對(duì)DM0872、DM0979、DM0976、DM1974和DM1973進(jìn)行致病性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有DM0979的致病性比野生型菌株有明顯降低，其互補(bǔ)