不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中微小RNA表達譜分析.pdf

1、本研究旨在通過Exiqon LNA miRNA芯片技術和TaqMAN stem-loop miRNA定量PCR技術，比較分析UA患者與健康人群血漿miRNA的表達譜，篩選UA組血漿中差異表達和變異穩(wěn)定的血漿miRNA分子，并進行定量PCR的驗證。
　　本研究技術路線:收集兩批UA患者和健康人群血漿樣本，分別用于血漿miRNA芯片檢測和qRT-PCR的驗證。通過芯片數據的前處理和數據分析，獲得UA患者血漿中差異表達的候選分子;其次，

2、收集第二批健康人群血漿樣本，進行血漿和細胞RNU6B表達分析;以RNU6B表達量為基線水平，進行芯片數據后處理，獲得可信度高的差異表達分子和內參分子。第三，通過定量分析驗證UA患者差異表達候選基因miR-9-3p在UA患者以及健康體檢人群血漿中是否存在顯著差異，進一步研究miR-9-3p對HepG2細胞膽固醇代謝調節(jié)關鍵蛋白ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding Cassette Transporter A1，ABCA1)基因

3、表達的影響，為miR-9-3p參與UA患者血脂調節(jié)提供佐證，以期為UA的早期臨床診斷提供潛在的分子標記物。
　　第一部分 不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿miRNA表達譜特征分析
　　目的:篩選UA患者血漿中差異表達miRNA分子。
　　方法:應用Exiqon miRCURY LNATM miRNA芯片技術，檢測血漿中miRNA的表達水平。采用統(tǒng)計學分析軟件R3.0.2中l(wèi)imma基因芯片分析程序包進行miRNA芯片數據分析。<

4、br>　　結果:1.研究對象基本特征
　　本實驗共入選UA患者150例（男性84名，女性66名），健康體檢人員175名（男性109名，女性66名），兩組間平均年齡分別為55±9歲、54±11歲?；咎卣?性別、年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C兩組間比較無顯著性差異（P＞0.05）(Table1)。
　　2.血漿miRNA芯片數據獲取與分析
　　2.1 血漿miRNA芯片數據歸一化數據處理
　　芯片

5、數據歸一化后，消除了芯片間的熒光信號的整體偏差。
　　2.2 血漿miRNA芯片數據的相關分析
　　健康對照組和UA組血漿中miRNA表達譜具有可重復性，相關系數分析為0.87±0.08(Table2)和0.94±0.05(Table3)。
　　2.3 血漿miRNA芯片數據火山圖
　　兩組間血漿中存在的大量差異表達miRNA分子（Fig3左上象限和右上象限）。
　　2.4 UA組血漿中miRNA的差異表達

6、分析
　　在UA患者血漿中，表達水平升高的miRNA共有207個(P＜0.01)，表達水平降低的miRNA共有134個(P＜0.01)。
　　結論:通過Exiqon miRNA芯片技術，獲得健康對照組和UA組血漿miRNA表達譜。
　　第二部分 經RNU6B血漿基線水平調整后UA患者血漿miRNA表達譜
　　目的:通過RNU6B血漿基線水平調整，獲得可信度高的UA患者血漿miRNA表達譜。
　　方法:本實驗

7、選取健康體檢人員10例（男性5例，女性5例）為研究對象，應用TaqMan探針miRNA實時熒光定量PCR技術檢測其血漿中RNU6B、miR-423-5p以及miR191-5p的表達水平，以HepG2細胞為研究對象，通過體外細胞培養(yǎng)技術、實時熒光定量PCR檢測HepG2細胞RNU6B的表達量。
　　實驗數據采用2-△CT進行分析，兩個獨立樣本采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析

8、，GraphPAD Prism5.0軟件對實驗數據進行作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.健康體檢人群基本特征
　　臨床資料統(tǒng)計示:研究對象平均年齡為43±6歲、男女比例1∶1、空腹血糖(FPG)為5.15±0.56 mmoL/L、總膽固醇(TC)為4.95±0.77mmoL/L、甘油三酯(TG)為1.13±0.35 mmoL/L、高密度脂蛋白（HDL-C）為1.04±0.32mmoL/L、低密度脂蛋白(L

9、DL-C)為2.94±0.81 mmoL/L(Table4)。
　　2.應用實時熒光定量PCR技術檢測10名健康體檢人員血漿RNU6B、miR-423-5p、miR-191-5p表達情況。
　　2.1 血漿中RNU6B表達水平顯著低于HepG2細胞內RNU6B表達水平(1.26×10-11vs2.04×10-8; P＜0.001)(Table5,Fig.4)。
　　2.2 血漿中RNU6B表達水平顯著低于血漿miR-4

10、23-5p表達水平(1.26×10-11vs7.94×10-8; P＜0.001)(Table6,Fig.4)。
　　2.3 血漿中RNU6B表達水平顯著低于血漿中miR-191-5p表達水平(1.26×10-11vs1.03×10-8; P＜0.001)(Table6、Fig.4)。
　　2.4 血漿中miR-508-3p和miR-509-5p的qRT-PCR的擴增循環(huán)數高于40Ct值，超出了qRT-PCR的檢出范圍，略低

11、于RNU6B的擴增循環(huán)數35-40。
　　3.RNU6B基線調整前后，UA組和健康對照血漿表達譜特征發(fā)生顯著變化，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001; Table7，Fig.5)。
　　結論:1.血漿中RNU6B的水平顯著性低于細胞內的表達水平。
　　2.RNU6B基線調整后，UA組和健康對照血漿表達譜特征發(fā)生顯著變化，為miRNA芯片數據后處理分析提供了實驗依據。
　　第三部分 miR-9-3p在不穩(wěn)定型心絞痛患

12、者血漿表達水平分析及對ABCA1表達水平的影響
　　目的:驗證miR-9-3p血漿表達水平在健康體檢人群以及UA患者是否存在顯著差異，判斷miR-9-3p對UA的診斷意義;從膽固醇代謝角度，探討其對HepG2細胞膽固醇代謝調節(jié)因子ABCA1轉錄水平以及蛋白水平表達的影響。
　　方法:本實驗選取UA患者30例，其中男性15例;女性15例;年齡、性別匹配的健康體檢人員28例，其中男性14例女性14例。采用mirVana miRN

13、A純化技術和TaqMan探針stem-loop miRNA定量PCR技術，檢測兩組血漿中miR-9-3p的表達水平。通過ROC曲線，判斷miR-9-3p對UA的診斷價值。以HepG2細胞為體外模型，通過細胞培養(yǎng)技術、體外轉染技術、實時定量PCR技術以及Western blotting免疫印跡技術，從轉錄水平和翻譯水平，研究miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1基因表達的影響。
　　臨床計數資料使用n(％)表示，計量資料使用均數

14、±標準差表示;兩組間數據比較計數變量采用卡方檢驗，計量數據兩組間比較采用t檢驗。實驗數據采用2-△CT法進行分析，應用中位數（四分位間距）來表示，相對表達倍數用2-△△Ct表示，兩組數據比較采用非參數t檢驗，應用ROC曲線分析計算出AUC曲線下面積和95％可信區(qū)間。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，SPSS16.0以及GraphPAD Prism5.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析及作圖。
　　結果:1.受試者人群的基本特征

15、>　　1.1 為了進行血漿miRNA差異表達驗證，收集健康體檢人群28例（男性14例;女性14例），平均年齡為56±8歲;UA組30例（男性15例;女性15例），平均年齡為56±10歲(Table11)。
　　1.2 UA組和對照組的基本資料比較:兩組間性別、年齡、FPG、TC、TG、HDL、LDL差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(Table11)。
　　2.UA組血漿中miR-9-3p的差異表達驗證
　　UA組血漿中

16、miR-9-3p的相對表達水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0001，Fig.6; Table12)。ROC曲線分析顯示:ROC曲線下面積(AUC)值為0.839，P＜0.0001，95％置信區(qū)間CI為:0.720-0.958(Fig7)。其AUC值介于0.7-0.9之間，說明miR-9-3p對UA的診斷具有一定的準確性。
　　3.miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1基因表達的影響
　　3.1 應用qR

17、T-PCR技術檢測HepG2細胞miR-9-3p mimics轉染效率
　　qRT-PCR結果顯示，轉染組HepG2細胞中miR-9-3p表達水平較陰性對照組升高了22.58倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001;Fig.8)。
　　3.2 miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1基因mRNA轉錄水平的影響
　　qRT-PCR結果顯示，兩組間ABCA1 mRNA水平無顯著性差異(Fig.9;P=0.583)。
　

18、　3.3 miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1蛋白水平的影響
　　通過Western blot技術檢測miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1蛋白水平的變化。分析結果顯示，miR-9-3p轉染組ABCA1的蛋白水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（Fig.10、Fig.11;P=0.03）。
　　結論:1.不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中miR-9-3p的表達水平顯著降低，血漿miR-9-3p有可能成為UA診斷的分子標志物