BMP-2誘導(dǎo)成骨分化過(guò)程與Wnt-β-catenin通路的串話機(jī)制研究.pdf

1、背景:基因治療和組織工程是目前研究解決骨損傷和骨疾病的熱門領(lǐng)域和具有希望前景的手段。間充質(zhì)干細(xì)胞因其成骨特性和潛能成為為骨再生和骨組織工程的種子細(xì)胞和基本要素。BMP-2的基因轉(zhuǎn)染能有效的治愈骨折骨缺損。多種細(xì)胞信號(hào)通路參與骨細(xì)胞的分化、增殖和代謝維持并存在相互協(xié)調(diào)或調(diào)節(jié)的影響，其中BMP信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路在骨的發(fā)生和發(fā)展中均起著關(guān)鍵性作用，由于兩者信號(hào)通路的復(fù)雜的分子基礎(chǔ)和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，它們?cè)诠切纬蛇^(guò)程中的作用更為復(fù)雜和多樣，具體詳

2、細(xì)的“串話”機(jī)制仍不明了。了解其中的關(guān)鍵機(jī)制將有助于骨相關(guān)疾病的藥物靶點(diǎn)治療和基因治療。
　　目的:(1)本研究通過(guò)使用攜帶rhBMP-2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(C3H101/2)研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質(zhì)粒的成骨效應(yīng)和C3H101/2的成骨活性;(2) BMP-2能否上調(diào)和激活Wnt/β-catenin通路中已經(jīng)明確的關(guān)鍵因子;(3)探討B(tài)MP-2/Smad信號(hào)通路對(duì)在Wnt/β-catenin通路的

3、交互可能作用機(jī)制和方式，試尋其中可能關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為今后骨相關(guān)疾病的基因治療和藥物靶點(diǎn)治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　一、rhBMP-2基因轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2的成骨活性和增殖能力研究
　　方法:在本實(shí)驗(yàn)第一部分主要通過(guò)以下幾種實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)完成研究。(1)通過(guò)已構(gòu)建的研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 C3H10T1/2細(xì)胞，利用質(zhì)粒本身攜帶的G418抗藥性對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩查，明確轉(zhuǎn)染是

4、否成功。(2)觀察pCDNA3.1質(zhì)粒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞上清液中的BMP-2含量的變化，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，從中觀察BMP-2的釋放機(jī)制和水平。(3)使用CCK-8試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-rhBMP-2基因重組質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行增值活性的檢測(cè)。(4)隨后對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其ALP活性并進(jìn)行ALP染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色了解其中成骨活性，了解其成骨強(qiáng)度變化。
　　結(jié)果:(1)BMP-2 ELISA結(jié)果顯

5、示:轉(zhuǎn)染組BMP-2濃度升高并維持在較高水平并且均明顯高于空白組和空載組(p＜0.05)。(2)轉(zhuǎn)染組的增殖趨勢(shì)最明顯，細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加而增加，其中細(xì)胞在第4d至第8d增殖最快，第8d后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。(3)ALP檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組在第7d至第21d增加最明顯，第21d達(dá)到高峰（P＜0.05）。(4)轉(zhuǎn)染組兩種ALP染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色均比空載組和空白組有較深的陽(yáng)性結(jié)果。
　　結(jié)論:(1)pcDNA3.1/rhBMP-2重組

6、質(zhì)粒是一種廉價(jià)、安全有效的轉(zhuǎn)染方式，能在一定時(shí)間內(nèi)平穩(wěn)和持續(xù)的高表達(dá)外源性BMP-2。(2)C3H10T1/2細(xì)胞是pcDNA3.1/rhBMP-2重組質(zhì)粒的良好宿主，能成骨表達(dá)外源性BMP-2。(3)BMP-2是有效骨誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)鈣的沉積。
　　二、BMP與Wnt信號(hào)通路串話作用在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的研究
　　方法:在第二部分中我們采用Western-blot和RT-PCR方法

7、檢測(cè)BMP-2誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞分化成骨細(xì)胞過(guò)程中Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵細(xì)胞因子β-eatenin、pβ-catenin、RUNX2、LEF1的表達(dá)情況，探討這些關(guān)鍵因子在BMP-2誘導(dǎo)成骨分化過(guò)程中的作用。同時(shí)檢測(cè)BMP-2/Smad信號(hào)通路中重要的調(diào)解因子Smurf-2水平和β-catenin關(guān)鍵的胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因子Axin、GSK3β，探討Smurf-2對(duì)β-catenin的可能影響機(jī)制。
　　結(jié)果:在

8、BMP-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，轉(zhuǎn)染組增加β-catenin mRNA的表達(dá)和促進(jìn)β-catenin蛋白磷酸化水平（t=7.609，p=0.002）。轉(zhuǎn)染組上調(diào)Wnt/β-catenin通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子LEF1的mRNA表達(dá)和蛋白合成（t=4.256，p=0.013）。在BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化中，Smurf-2mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組少（t=7.609,p=0.013）。轉(zhuǎn)染BMP-2基因后能明顯上調(diào)提高BMP-

9、2mRNA，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin降解復(fù)合體GSK3β-APC-Axin2的表達(dá)起下調(diào)作用。
　　結(jié)論:在探討B(tài)MP信號(hào)通路和Wnt/β-catenin通路在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的串話機(jī)制中，我們發(fā)現(xiàn)成骨分化過(guò)程中BMP信號(hào)通路與Wnt/β-catenin通路存在串話機(jī)制。(1)BMP-2能上調(diào)Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵細(xì)胞因子β-catenin、pβ-catenin、RUNX2、LEF1的表達(dá)，參與Wnt/β-ca