周細(xì)胞對(duì)新生血管滲漏性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管滲漏性增高是病理性新生血管(如惡性腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DRP)、角膜新生血管等)的重要特征。液體、血漿蛋白、活性分子和細(xì)胞的滲出導(dǎo)致組織水腫、機(jī)化和免疫微環(huán)境的破壞，從而加重炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，給機(jī)體帶來(lái)許多不利影響甚至威脅生命。以往對(duì)血管滲漏性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究(如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial cellsgrowth factor,VEGF)

2、、組胺等)多集中于內(nèi)皮細(xì)胞屏障，而作為微血管壁細(xì)胞組分之一的周細(xì)胞在滲漏性的調(diào)節(jié)中所起的作用長(zhǎng)期以來(lái)被人們所忽略。微血管壁由周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞組成，二者共同構(gòu)成了微血管的屏障，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。近年來(lái)由于周細(xì)胞在血管生成、穩(wěn)定和重建中的重要調(diào)控作用而日漸受到重視。最近，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)可顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)熒光素鈉的通透率，且其屏障功能與周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例呈正相關(guān)改變。然而在動(dòng)物模型中周細(xì)胞對(duì)新

3、生血管滲漏性是否具有調(diào)節(jié)作用，目前尚未證實(shí)。 本課題建立堿燒傷誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管(Corneal neovascularization，CNV)模型，用伊文氏蘭(Evans blue，EB)示蹤法檢測(cè)新生血管滲透率，抗α-SMA和抗CD31分別標(biāo)記周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的雙重免疫熒光染色法觀察并定量分析血管新生過(guò)程中周細(xì)胞的募集情況；建立角膜基質(zhì)層間植入微粒體誘導(dǎo)的大鼠CNV模型，實(shí)驗(yàn)性阻斷周細(xì)胞募集后比較新生血管滲透率的變

4、化，以評(píng)價(jià)周細(xì)胞對(duì)新生血管滲漏性的影響。從而進(jìn)一步完善新生血管滲漏性調(diào)節(jié)的理論研究；為誘導(dǎo)新生血管成熟，降低滲漏性做出探索；為新生血管性疾病的抗?jié)B漏治療提供新的策略。 第1章大鼠角膜堿燒傷后新生血管滲漏和VEGF變化的研究。 目的：研究大鼠角膜堿燒傷后新生血管滲透率的變化并探討VEGF對(duì)滲透率的影響。 方法：建立堿燒傷誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管模型，于術(shù)后1，2，3，5，7，10d(各6只眼)伊文氏蘭示蹤法檢測(cè)新生

5、血管滲透率，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)法檢測(cè)角膜組織中VEGF-RNA的表達(dá)。以正常大鼠角膜(6只眼)作為對(duì)照。 結(jié)果：正常及堿燒傷后1，2，3，5，7，10d大鼠角膜新生血管滲透率依次為0，1.14±0.17，0.24±0.08，0.294±0.16，0.144±0.10，0.094±0.06和0.05±0.04μg/ml/mm<

6、'2>：角膜組織中VEGF-RNA水平依次為1.094±0.31×10<'6>，7.01±1.99×10<'6>，1.01±0.59×10<'6>，2.43±0.43×10<'6>，0.99±1.31×10<'6>，0.95±0.03×10<'6>和0.17±0.15×10<'6>拷貝/μg總RNA，其中7d和10d的VEGF-RNA低于正常水平(P<,7d>=0.011，P<,10d>=0.006)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，新生血管

7、滲透率和VEGF-RNA水平呈正相關(guān)改變，相關(guān)系數(shù)為0.866(P<0.01)。 結(jié)論：VEGF在新生血管滲漏的調(diào)節(jié)機(jī)制中起著重要作用；大鼠角膜堿燒傷后期，新生血管滲漏性增高難以應(yīng)用VEGF機(jī)制進(jìn)行解釋的現(xiàn)象，提示可能存在其它的新生血管滲漏調(diào)節(jié)機(jī)制。 第2章大鼠角膜堿燒傷后新生血管對(duì)周細(xì)胞募集的研究。 目的：研究大鼠角膜堿燒傷后新生血管對(duì)周細(xì)胞的募集并探討周細(xì)胞包裹程度與新生血管滲透率的關(guān)系。 方法：建立

8、堿燒傷誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管模型，分別于術(shù)后1，2，3，5，7，10d(各6只眼)采用抗α-SMA和抗CD31對(duì)角膜切片行雙重免疫熒光染色法及透射電鏡觀察新生血管對(duì)周細(xì)胞的募集情況。采用周細(xì)胞包裹指數(shù)(Pericytecoverage index，MPI)對(duì)之進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：堿燒傷后早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞自角膜基質(zhì)淺層向深層方向生長(zhǎng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞早于周細(xì)胞出現(xiàn)并領(lǐng)先周細(xì)胞的發(fā)展。至堿燒傷后晚期，角膜基質(zhì)深層未被周細(xì)胞

9、包裹的新生血管開(kāi)始消退；MPI在堿燒傷后1，2，3，5，7，10d依次為0，16.07﹪，11.95﹪，43.84﹪，73.97﹪和86.21﹪。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，MPI與新生血管滲透率呈負(fù)相關(guān)改變，相關(guān)系數(shù)為．-0.9413(P=-0.005)。 結(jié)論：角膜新生血管滲透率與周細(xì)胞的包裹程度密切相關(guān)；周細(xì)胞是新生血管成熟和穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。 第3章周細(xì)胞對(duì)大鼠角膜新生血管滲漏性影響的研究。 目的：比較

10、阻斷周細(xì)胞募集過(guò)程后角膜新生血管滲透率的改變，探討周細(xì)胞對(duì)新生血管滲漏性的影響。 方法：建立角膜基質(zhì)層間植入微粒體誘生新生血管的大鼠模型，隨機(jī)分配同一只大鼠的左右眼為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組植入含有VEGF+ami-PDGF-B的微粒體(9只眼)，對(duì)照組植入含有VEGF+PBS的微粒體(9只眼)，術(shù)后5天伊文氏蘭示蹤法檢測(cè)新生血管滲透率，角膜稱重，抗α-SMA和抗CD31對(duì)角膜切片及全角膜行雙重免疫熒光染色法觀察并計(jì)算周細(xì)胞包裹指

11、數(shù)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組MPI為11.3﹪，角膜重量為8.96±1.09mg，新生血管滲透率為0.68±0.36μg/ml/mm<'2>；對(duì)照組MPI為56.5﹪，角膜重量為7.36±0.56mg，新生血管滲透率為0.24±0.07μg/ml/mm<'2>，三個(gè)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間比較均有顯著性差異(P<,MPI><0.01，P<,滲透率>=0.011，P<,重量>=0.011)。 結(jié)論：周細(xì)胞對(duì)新生血管滲漏性具有重要的調(diào)