可溶性Aβ-,25-35-對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道m(xù)RNA表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的： Alzheimer’s病(AD)是影響記憶和認(rèn)知功能的進(jìn)行性退化性神經(jīng)病變，是癡呆最常見的原因。研究表明，β淀粉樣蛋白(Aβ)增加是AD中樞病因性過程，凝聚態(tài)Aβ具有明確的神經(jīng)毒性作用。但亦有研究提出，Aβ在纖維性沉積前即可溶性Aβ也可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位，直接參與記憶的獲取和建立。海馬CA3區(qū)與空間辨別性學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。而學(xué)習(xí)和記憶存儲(chǔ)的分子和生理機(jī)制研究表明，鉀通道、蛋白激酶C、記憶相關(guān)蛋白

2、Cp20、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)在學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制中起重要作用，其中鉀離子通道在學(xué)習(xí)和記憶中起著關(guān)鍵作用，提示鉀通道在老年癡呆發(fā)病過程中具有重要意義。有研究認(rèn)為可溶性Aβ25-35對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鐘電流(Ik)有明顯抑制作用，其效應(yīng)具有時(shí)間依賴性和電壓依賴性，但具體作用機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)以大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元為研究對象，采用膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究可溶性Aβ25-35對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)

3、元幾種代表性延遲整流鉀通道亞型mRNA表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)的角度探討Ik變化的分子機(jī)制。為研究Aβ在AD發(fā)病過程中的作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用鉀通道調(diào)節(jié)劑預(yù)防和治療AD提供理論依據(jù)。 方法： 采用酶解和機(jī)械分離相結(jié)合的方法，急性分離新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元。運(yùn)用膜片鉗，借助其電極形成的吸收通道提取單個(gè)細(xì)胞，然后對其進(jìn)行單細(xì)胞水平的分子生物學(xué)研究。由于單個(gè)細(xì)胞中提取的mRNA數(shù)量很少，應(yīng)用傳統(tǒng)的單對引物對單細(xì)胞mRNA

4、進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物結(jié)果不夠理想，故本實(shí)驗(yàn)采用的巢式設(shè)計(jì)的兩對PCR引物，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增后凝膠電泳成像分析，觀察可溶性Aβ25-35對大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀離子通道亞型Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.延遲整流鉀通道亞型Kv1.2，Kv1.5，Kv2.1在正常大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元上均有不同程度的表達(dá)。其中，Kv2.1的表達(dá)水平較高。

5、2.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv1.2mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比明顯降低，分別降低15.9％(P<0.01)、24.0％(P<0.01)、35.8％(P<0.01)。 3.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv1.5mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比明顯降低，分別降低

6、17.8％(P<0.01)、23.2％(P<0.01)、36.1％(P<0.01)。 4.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv2.1mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比明顯降低，分別降低17.2％(P<0.01)、23.7％(P<0.01)、36.9％(P<0.01)。 5.加入濃度為5.0μM可溶性Aβ25-35孵育1、3、5、8、10分鐘后，大

7、鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv2.1mRNA的相對表達(dá)量與對照組相比明顯降低，分別降低了38.7％(P<0.01)、43.5％(P<0.01)、53.3％(P