抗抗生素類藥物抗體的檢測與研究和稀有血型分子生物學篩查.pdf

1、在臨床治療過程中使用藥物，特別是使用抗菌素類藥物時，機身除了會產(chǎn)生藥物耐受之外，還有可能產(chǎn)生針對此種藥物的抗藥物抗體。當機體產(chǎn)生抗藥物抗體之后，藥物、抗藥物抗體及紅細胞會形成一種免疫復合物，導致機體對紅細胞的破壞清除，引起免疫溶血性貧血、藥物使用無效以致危及患者生命安全。雖然產(chǎn)生抗藥物抗體的幾率很低，但至今為止已報道有超過100種藥物可以引發(fā)抗藥物抗體的產(chǎn)生。隨著科技的進步及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，越來越多的藥物會投入使用。因此，建立一種有效的

2、檢測抗藥物抗體的方法，對藥物引發(fā)的免疫溶血性貧血的檢測，病因的確定，指導用藥等方面都有著重要的意義。使用藥物、紅細胞與患者的血漿及紅細胞放散液進行血清學反應，一直作為經(jīng)典的檢測血液中抗藥物抗體的方法。但使用藥物包被的紅細胞并不能充分的說明患者體內(nèi)的抗藥物抗體究竟是針對于藥物與紅細胞膜的復合結(jié)構(gòu)，還是針對于藥物修飾作用以后的紅細胞膜結(jié)構(gòu)，所以，弄清藥物引發(fā)抗藥物抗體產(chǎn)生的機制，對于定義抗藥物抗體的類型有著深遠的意義。
　　 本研究

3、中選取了目前上海市各大臨床醫(yī)院使用頻率靠前的青霉素、阿奇霉素、左氧沙星、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢拉定、頭孢他啶與頭孢克洛9種抗生素類藥物，在特殊的緩沖體系下，構(gòu)建了藥物包被的RBC。使用藥物包被的RBC對樣本進行抗藥物抗體的檢測，主要針對半抗原機制的抗藥物抗體與藥物作用于RBC膜后引發(fā)的新的自身抗體。對181例樣本（在上海市血液中心血型參比實驗室進行疑難配血的樣本61例，進行Coombs’試驗與抗體篩查的樣本51例以及在瑞金醫(yī)

4、院進行骨髓移植的樣本70例）進行檢測。使用熒光素標記的抗體，對頭孢菌素處理的RBC進行CD55與CD59的改變情況進行檢測。并以青霉素為代表藥物，使用Far-Western-Blotting的方法，對藥物與RBC膜蛋白的作用進行研究。
　　 通過血清學方法，使用藥物包被的RBC檢測181例樣本，在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在疑難配血的61個樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本4例(6.56％)，特異性抗頭孢菌素類藥物抗體1(0.16％)例，

5、非特異性抗藥物抗體2(0.33％)例；在抗體篩查與Coombs’試驗的50個樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本4(8％)例；在進行骨髓移植的70個樣本中，發(fā)現(xiàn)含有特異性抗青霉素抗體的樣本1(1.43％)例；針對藥物來說，在全部181個樣本中，產(chǎn)生的針對青霉素類藥物的抗體是最多的，為9例(4.97％)，產(chǎn)生了針對頭孢菌素類藥物抗體l例(0.55％)，而非特異性抗藥物抗體為2例(1.1％)。流式細胞結(jié)果顯示，使用頭孢菌素處理的RBC膜

6、上CD55與CD59的含量均有下降。Far-Western-Blotting檢測結(jié)果顯示與青霉素作用的RBC膜蛋白分子量在130KD以上。
　　 機體只有很低的概率會產(chǎn)生抗藥物抗體，青霉素與RBC膜蛋白作用的結(jié)果提示藥物可能作用于血型蛋白上。藥物會與哪些RBC膜蛋白進行結(jié)合仍不得知。
　　 本論文另一項研究是分析中國人群中CO、YT、LU、K、DI五種稀有血型等位基因的頻率。人體的紅細胞上有約300種抗原物質(zhì)，屬于30個

7、血型系統(tǒng)，每種血型系統(tǒng)都會有很低的幾率不表達某種血型抗原。這類紅細胞便會呈現(xiàn)出稀有血型。使用常規(guī)的血清學檢測很難發(fā)現(xiàn)稀有血型的存在，在臨床上有可能會導致輸血反應的發(fā)生。對于很難用血清學方法檢測出的稀有血型個體，可以使用分子生物學方法，建立起穩(wěn)定的稀有血型檢測體系。對輸配血的個體進行稀有血型檢測，最大可能降低由稀有血型引起的輸血反應。
　　 根據(jù)CO、YT、LU、K、DI等血型基因的SNP位點，設計出序列特異性引物，建立穩(wěn)定的擴增

8、體系，并在一個體系中，進行多種稀有血型抗原基因的篩查。經(jīng)過不斷優(yōu)化序列特異性引物與擴增條件，建立了穩(wěn)定的稀有血型抗原基因擴增體系。在研究中總共篩查了438例樣本（上海市隨機樣本321例，土族樣本61例，侗族28例，傈僳族28例）Coa、Kpb、yta、Lub、k、Dib、Jsbl910、Jsb2019等5個血型系統(tǒng)的8個抗原基因位點的篩查。經(jīng)多重PCR-SSP方法檢測，在所有樣本中，檢測出Coa陰性樣本o例，Kpb陰性樣本o例，yta陰

9、性樣本o例，Lub陰性樣本0例，k陰性樣本0例，Dib陰性樣本0例，Jsbl910陰性樣本0例，Jsb2019陰性樣本O例。
　　 本研究在常規(guī)對抗藥物抗體篩選的基礎(chǔ)上，進一步的對抗藥物抗體產(chǎn)生的機理也做出了初步的研究。并使用藥物代替常規(guī)標記蛋白作為橋聯(lián)分子，采取Far-Western-Blotting的方法對RBC膜蛋白上的藥物靶位點進行研究。通過建立藥物包被的RBC檢測抗藥物抗體并對其進行機理性的研究，可以發(fā)現(xiàn)，在使用抗生素

10、的人群中，確實有一定的幾率出現(xiàn)抗藥物抗體。RBC在與頭孢菌素結(jié)合后，其表面某些蛋白含量會發(fā)生變化。另一方面，使用多重PCR-SSP對血型抗原基因進行篩查，彌補了現(xiàn)有的血清學檢測方法僅能檢測少數(shù)稀有血型抗原，且應用時往往受到抗體缺乏或效價低下的限制，擴大稀有血型抗原檢測范圍，并應用于臨床標本的檢測。研究中雖然出現(xiàn)了假陽性的結(jié)果，但只要配合血清學實驗技術(shù)及其他進一步的檢測，在輸血治療之前檢測稀有血型抗原表達情況，有助于針對性地篩選相配合的血