ABCG2基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黃曲霉毒素M1的影響.pdf

1、黃曲霉毒素(AF)被劃定為I類致癌物，黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種主要的黃曲霉毒素，其污染物大大降低了食物的安全水平，對(duì)人類的健康有重大的威脅。黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代謝產(chǎn)物，奶牛攝入被AFB1污染的飼料，15min后可在血液中檢測(cè)到AFM1，8h后可在奶中檢測(cè)到AFM1。部分AFM1會(huì)隨乳汁、尿液排出，一部分則留在動(dòng)物的可食用的組織和器官如血、腎、肝等。AFM1在乳汁中最為常見(jiàn)，這使得牛奶及其奶制品成為易受

2、AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障對(duì)AFM1攝取的機(jī)理，將有助于有效地減少奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)血液循環(huán)中AFM1的攝取，從而保證我國(guó)牛奶以及奶制品的質(zhì)量安全。
　　為了研究奶牛血乳屏障對(duì)AFM1的攝取方式以及轉(zhuǎn)運(yùn)AFM1的分子機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上，在體外構(gòu)建了奶牛血乳屏障模型。在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障是由單一的乳腺上

3、皮細(xì)胞增殖而來(lái)。激光掃描共聚焦結(jié)果顯示，乳腺上皮細(xì)胞之間形成了較好的緊密連接，而且乳腺上皮細(xì)胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障模型可以成為體外研究藥物在血乳屏障中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的模型。
　　為了研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)AFM1的攝取方式，通過(guò)采用熒光定量PCR檢測(cè)了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對(duì)體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因m

4、RNA表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表達(dá)量較高，有可能參與AFM1在血乳屏障中的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，我們也采用Western blotting方法檢測(cè)了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對(duì)ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示與不添加AFM1培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞相比，ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量顯著提高(P＜0.01)，這種結(jié)果更大程度上表明ABCG2和ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與AFM1轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。
　　為了

5、進(jìn)一步研究ABCG2對(duì)AFM1轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響，試驗(yàn)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，從而進(jìn)行ABCG2基因的過(guò)表達(dá)試驗(yàn)研究;同時(shí)應(yīng)用RNA干擾的方法用ABCG2 siRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，從而進(jìn)行ABCG2基因的抑制試驗(yàn)研究。再通過(guò)采用熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)在培養(yǎng)體系中添加AFM1對(duì)體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響，同時(shí)采用液

6、相色譜法對(duì)收集的細(xì)胞和Transwell上室的培養(yǎng)液中AFM1的含量進(jìn)行檢測(cè)。熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示:ABCG2基因的過(guò)表達(dá)和抑制對(duì)ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量均有極顯著性影響(P＜0.01)，而對(duì)β-酪蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。AFM1液相色譜結(jié)果顯示:ABCG2基因過(guò)表達(dá)上調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P＜0.01)，ABCG2基因抑制下調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含