神經(jīng)管畸形模型的建立及RARα和Hoxd4基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　 通過孕期一次性投入大劑量維生素A類物——全反式維甲酸，建立SD大鼠胎鼠的神經(jīng)管畸形模型，觀察E20天實(shí)驗(yàn)組及對照組胎鼠發(fā)生先天畸形的種類，幾率，記錄其身長、體重進(jìn)行比較，并進(jìn)行病理組織切片，比較觀察其組織結(jié)構(gòu)的改變和缺損，說明全反式維甲酸對胚胎發(fā)育的限制性和毒性作用以及其致畸性;取實(shí)驗(yàn)組及對照組E12，E13，E14，E15，E16天胚胎的神經(jīng)管，檢測RARαmRNA及Hoxd4 mRNA的表達(dá)，了解神經(jīng)管畸形形成

2、過程中RARα及Hoxd4的異常表達(dá)，探討神經(jīng)管畸形發(fā)生的可能機(jī)制，為神經(jīng)管畸形的預(yù)防提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.胎鼠神經(jīng)管畸形模型的建立:正常懷孕的SD大鼠隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組于大鼠孕10天時(shí)，一次性給予濃度為20mg/ml，劑量為120mg/kg的atRA，所用溶劑為食用橄欖油;對照組于大鼠孕10天時(shí)給予同樣體積的橄欖油。于孕20天剖宮取胎，觀察胚胎的先天畸形情況，記錄其身長、體重及數(shù)量。
　

3、　 2.病理切片:取實(shí)驗(yàn)組有明顯脊柱裂的胎鼠的腰骶部及其以下組織及對照組正常胎鼠的腰骶部及其以下組織，常規(guī)石蠟包埋、H—E染色。觀察其病理形態(tài)的變化。
　　 3.RARα及Hoxd4mRNA的檢測:取實(shí)驗(yàn)組及對照組12，13，14，15，16天胚胎的神經(jīng)管組織，利用RT-PCR測定RARαmRNA及Hoxd4mRNA的表達(dá)，了解其在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.神經(jīng)管畸形動物模型及其伴發(fā)畸形:

4、E20天實(shí)驗(yàn)組10只孕鼠胎鼠接受統(tǒng)計(jì)，胚胎總數(shù)109只，其中死胎5只β4.59％)，吸收胎6只(5.50％)，神經(jīng)管畸形胎鼠65只(66.33％)，類型均為脊柱裂，未發(fā)現(xiàn)腦膨出、無腦兒等其他類型的神經(jīng)管畸形，有神經(jīng)管畸形的胎鼠均伴有無尾無肛門畸形。對照組10只孕鼠，共獲得胎鼠125只，無死胎及吸收胎，胎鼠外觀均未出現(xiàn)上訴畸形。實(shí)驗(yàn)組與對照組在妊娠第20天時(shí)身長及體重各數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。實(shí)驗(yàn)組均較對照組

5、發(fā)育差，身長、體重均低于對照組。切片形態(tài)學(xué)觀察:對照組骶、尾椎發(fā)育良好，脊髓形態(tài)正常，灰白質(zhì)分布清楚，灰質(zhì)呈蝶形分布，被覆皮膚連續(xù);實(shí)驗(yàn)組胚胎中則可見腰骶部脊柱裂，脊髓脊膜膨出、脊髓形態(tài)改變，灰白質(zhì)分布紊亂，灰質(zhì)蝶形區(qū)消失，多見炎癥細(xì)胞侵潤，被覆皮膚不連續(xù)。
　　 2.維甲酸誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)管畸形胚胎中RARαmNR及Hoxd4mNRA表達(dá)的研究:對照組RARαmRNA在E12天開始測得表達(dá)，到E14天時(shí)處于表達(dá)高峰，E15天開始下

6、降，E16天時(shí)降至E13天水平;實(shí)驗(yàn)組中RARαmRNA在E12天時(shí)就處于表達(dá)高峰，之后表達(dá)量逐漸下降，E12，E13，E14天表達(dá)量均高于對照組同一時(shí)段表達(dá)量(P=0.000＜0.05),E15天表達(dá)量稍低于對照組同一時(shí)段表達(dá)水平(P=0.001＜0.05)，至E16天時(shí)表達(dá)量降至對照組E16天水平(P=0.311＞0.05)。對照組Hoxd4mRNA在E12天開始測得表達(dá)，之后表達(dá)量逐漸增高，到E15天時(shí)處于表達(dá)高峰，之后表達(dá)下降，

7、E16天時(shí)降至E13天水平;實(shí)驗(yàn)組Hoxd4mRNA在E12天就處于表達(dá)高峰，E12，E13，E14天表達(dá)量均高于對照組同一時(shí)段的表達(dá)量(P=0.000＜0.05)，到E15、E16天時(shí)，表達(dá)量稍低于對照組同一時(shí)段水平(P=0.000＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.孕期特定時(shí)間一次性投入大劑量的全反式維甲酸可限制胚胎的生長發(fā)育，并造成神經(jīng)管畸形在內(nèi)的多種畸形。
　　 2.RARα及Hoxd4基因的異常高表