TGase1,ACPase及APLPase A2酶活性參與脫屑機(jī)理和異常脫屑療效的探討.pdf

1、背景：正常皮膚表皮細(xì)胞中,95％為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC),其余5％的細(xì)胞為黑色素細(xì)胞,朗旱氏細(xì)胞以及梅克氏細(xì)胞。此種角質(zhì)形成細(xì)胞由基底膜上的基底干細(xì)胞增殖增大成為棘細(xì)胞,進(jìn)行分化并向淺層移行為顆粒層和角質(zhì)層。在棘細(xì)胞層中,角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)分化產(chǎn)物有角質(zhì)蛋白絲和板層小體等。板層小體內(nèi)除去脂類(lèi)以外,還有溶酶體酶(lysosomal enzyme),如酸性磷酸酶(acid phosphotase,ACPase)、酸性磷脂

2、酶A(acid phospholipase A,APLPase A2)等則分泌至KC之間。它與KC加厚的細(xì)胞膜套,即角化膜套(cornified envelope),及細(xì)胞間隙的脂質(zhì)膜套(lipidenvelope)借助轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1(transglutaminasel,TGase1)活性的交聯(lián)作用而共同形成表皮屏障(epidermal barrier)。淺層角質(zhì)的KC相互解離,凋亡而脫屑。異常脫屑患者的表型呈現(xiàn)KC相互之間不解離而堆積

3、為片狀鱗屑。板層魚(yú)鱗病(LI)患者為隱性遺傳的KC代謝異常;銀屑病為免疫源性炎癥的KC代謝異常。兩者KC的代謝異常皆可導(dǎo)致凋亡不全(角化不全/凋亡不全(parakeratosis/paraapoptosis),呈現(xiàn)異常脫屑。臨床上常應(yīng)用尿素、維A酸以及激素等對(duì)癥治療異常脫屑,這些藥物具有一定療效,但可呈現(xiàn)副作用,如表皮萎縮和導(dǎo)致表皮屏障功能不良等。Fartasch M等學(xué)者曾將低濃度a-羥酸類(lèi)的乙醇酸應(yīng)用于表皮脫屑研究。他們認(rèn)為乙醇酸可

4、降解淺層角質(zhì)KC間的橋粒物質(zhì)而脫屑,但并不損害皮膚的屏障功能。關(guān)于正常/異常脫屑的機(jī)理及對(duì)異常脫屑的對(duì)癥治療方面國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的很有限,但在臨床上卻是常見(jiàn)的問(wèn)題。本研究一方面觀察不同濃度乙醇酸對(duì)不同程度的異常脫屑患者的應(yīng)用方式;另一方面,通過(guò)對(duì)比異常脫屑患者和健康人皮屑內(nèi)酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性和反映表皮屏障功能的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1活性等探討正常/異常脫屑的機(jī)理。本研究采取板層魚(yú)鱗病(LI)和尋常銀屑病(PV)患者的鱗屑鋪片標(biāo)本,

5、以健康人為對(duì)照,應(yīng)用組織/細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1活性,酸性磷酸酶活性和酸性磷脂酶A2活性檢測(cè),進(jìn)一步探討表皮脫屑的機(jī)理。并對(duì)LI志愿者(對(duì)個(gè)別重度LI患者進(jìn)行TGase1基因測(cè)序)的局部皮膚每日一次施以低濃度的乙醇酸-甘油,對(duì)異常脫屑(呈片狀磷屑)患者進(jìn)行初步療效觀察,為異常脫屑患者的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法：1.采集標(biāo)本對(duì)10例LI患者(4例重度,4例中度及2例輕度),10例尋常型銀屑病患者和10例健康志愿

6、者收集皮屑標(biāo)本,低溫保存。另對(duì)一例重癥LI患者抽取10ml靜脈血用枸櫞酸鈉抗凝后送基因公司檢測(cè)TGM1基因序列。2.不同濃度乙醇酸對(duì)不同程度的異常脫屑LI患者的應(yīng)用方式以乙二醇為溶劑,36％的乙醇酸為溶質(zhì),配成不同濃度的乙醇酸溶液。對(duì)重度LI患者應(yīng)用終濃度3-4％的乙醇酸-甘油(50％甘油);對(duì)中、輕度LI患者應(yīng)用1-2％的乙醇酸-甘油,每日一次局部外用,2周后觀察照相。3.顯示酸性磷酸酶活性對(duì)鱗屑鋪片標(biāo)本用10％的福爾馬林鈣固定30m

7、in→底物孵育液(醋酸鈉0.585g+雙蒸水5ml→取2.5ml+1ml8.5％NaCl+0.1N HCl+4ml雙蒸水→取6ml+3.3％硝酸鉛0.19ml+雙蒸水16ml+3.2％beta甘油磷酸鈉2ml+0.6％MgSO40.5ml以1N HCl調(diào)至pH5.6,用前過(guò)濾。)滴在玻片上,置37℃溫箱4h→蒸餾水洗→1％醋酸作用30s→蒸餾水洗3次→2％(NH4)2S1-2min流水→洗5min→顯微鏡下觀察照相(同時(shí)做不加底物培育的

8、陰性對(duì)照)。4.TGase1酶活性的檢測(cè)首先制備鱗屑鋪片標(biāo)本和HRP(辣根過(guò)氧化物酶)—單丹酰偶聯(lián)物(HRP-MDC);HRP-MDC的制備和檢測(cè)TGase酶活性如下:①活化/氧化HRP以過(guò)碘酸活化/氧化HRP,4℃下以1mmol/L醋酸緩沖液透析過(guò)夜除去多余的NaIO4。②4mg單丹酰尸胺(mono-dansyl cadaverine,Sigma,US)溶于1ml PBS,與活化的HRP室溫?cái)嚢?h,形成偶聯(lián)物。③加新配的0.05ml

9、(4mg/ml)NaBH4(硼氫化鈉,Sigma,US),4℃反應(yīng)2h,還原Schiff堿。④以HRP-MDC檢測(cè)TGase酶活性:A液0.05mol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L CaCl2,1％BSA與B液HRP-MDC混合(1:1),4℃過(guò)夜孵育各鱗屑鋪片標(biāo)本,DAB顯色。⑤同時(shí)做不加底物孵育的陰性對(duì)照。⑥顯微鏡下觀察,照相。5.顯示酸性磷脂酶A2活性作用底物(1％卵磷脂水溶液10ml、2％氯化鈣水溶液1

10、0ml、0.1M甘氨酸緩沖液,pH5.5)→將底物滴在玻片上37℃浸漬15-36h→蒸餾水洗2-3min→加入膠體Nile藍(lán)60℃染色30min→水沈2-3 min→顯微鏡下觀察照相(同時(shí)做不加底物培育的陰性對(duì)照)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用圖像分析儀(Shan Fu,China)掃描灰度均值(GSM)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,以α=0.05為檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)

11、果：1.一例重度L1患者的TGM1基因測(cè)序,顯示TGase1基因突變主要為第Ⅲ外顯子內(nèi)第150位堿基(T)缺失,而導(dǎo)致移碼突變。2.多數(shù)(80％)LI患者治療,包括經(jīng)TGM1基因測(cè)序的重度L1患者,1-4周后異常脫屑表型可獲得一定改善。3.健康人ACPase酶活性呈黑色細(xì)顆粒主要定位于KC的細(xì)胞間橋,異常脫屑患者酶活性呈非特異的灰色,活性缺乏或缺如,很少見(jiàn)到細(xì)胞間橋處呈酶活性。4.健康人TGase1酶活性呈棕色細(xì)顆粒定位于KC表面,異常

12、脫屑患者酶活性皆缺乏或缺如。5.健康人APLase A酶活性呈蘭色細(xì)顆粒定位于KC細(xì)胞間隙。異常脫屑患者酶活性皆缺乏或缺如。
　　結(jié)論：1.ACPase和APLPase A2酶參與脫屑過(guò)程,它們定位于角質(zhì)形成細(xì)胞間隙,患者組中明顯缺如。2.TGase1酶定位于角質(zhì)形成細(xì)胞的表面,參與角化膜套和類(lèi)脂膜套的交聯(lián),患者組中明顯缺如。3.低濃度的乙醇酸和甘油對(duì)癥治療魚(yú)鱗病能明顯改善板層魚(yú)鱗病的表型,包括一例經(jīng)TGM1基因測(cè)序的重度LI患者