耐伊曲康唑申克孢子絲菌體外藥敏和分子生物學(xué)特性研究.pdf

1、孢子絲菌病是流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)由申克孢子絲菌引起的皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染,可累及臟器,具有一定致殘、致死率。根據(jù)《美國傳染病協(xié)會2007版申克孢子絲菌病臨床治療指南》推薦,伊曲康唑為非系統(tǒng)性孢子絲菌病的首選單獨治療藥物。我們在臨床上發(fā)現(xiàn)3例對伊曲康唑治療不敏感的皮膚型孢子絲菌病患者,從中首次分離出4株申克孢子絲菌臨床耐藥株,但申克孢子絲菌的耐藥研究還是空白。本研究通過對這4株耐藥株進行形態(tài)學(xué)、雙相型轉(zhuǎn)化試驗

2、、掃描電鏡、ITS序列、體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗研究,同時采用RAPD技術(shù)進行臨床耐藥株和敏感株的基因型差異分析,探討申克孢子絲菌耐藥株和敏感株在表型、基因型和藥物敏感性等方面的差異；同時獲取了其編碼細胞色素P-450羊毛固醇14-α-脫甲基酶的耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達序列片段,為分子耐藥機制研究打下基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.明確耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株的形態(tài)學(xué)表型、基因型和體外藥敏的特性;
　　

3、 2.探討申克孢子絲菌臨床耐藥株和敏感株的基因型差異,獲取其耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因的表達序列片段,為分子耐藥機制研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.通過真菌鏡檢、培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗和掃描電鏡技術(shù)對所分離臨床耐藥株進行形態(tài)學(xué)鑒定；
　　 2.采用真菌通用引物ITS4、ITS5進行PCR擴增申克孢子絲菌臨床耐藥株的rDNA ITS區(qū)序列,產(chǎn)物經(jīng)純化、測序后進行分子生物學(xué)鑒定；
　　 3.應(yīng)用M

4、38-A方案和改良M27-A2藥敏試驗方案對申克孢子絲菌臨床耐藥株進行菌絲相和酵母相的體外藥敏試驗?；罨?分別制備菌絲相和酵母相菌懸液,菌絲相濃度調(diào)整至5×104CFU/ml(2倍終濃度),酵母相調(diào)整至2.5×103CFU/ml(2倍終濃度)；采用微量液基稀釋法加樣制板后,菌絲相置26℃,酵母相置35℃孵育,第5d觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為各藥的MIC終點為100％生長抑制,聯(lián)合用藥效果評價采用分數(shù)抑菌濃度指數(shù)評價；
　　 4

5、.采用OPBG14和OPBG19兩條引物進行RAPD,PCR擴增4株臨床耐藥株及46株臨床非耐藥株及1株標(biāo)準(zhǔn)株。對擴增的RAPD帶型進行分析采用BioNumerics v.4.61軟件統(tǒng)計出各菌株的歐式遺傳距離,并按照Ward's algorithm with Jaccad's coefficient法進行聚類分析,繪出親緣關(guān)系樹狀圖。
　　 5.提取申克孢子絲菌總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用針對耐唑類抗真菌藥物相關(guān)基因——編碼細胞色素

6、P-450羊毛固醇14-α-脫甲基酶基因片段的引物進行PCR擴增。
　　 結(jié)果:
　　 1.4株耐伊曲康唑申克孢子絲菌臨床株經(jīng)真菌培養(yǎng)、小培養(yǎng)、雙相轉(zhuǎn)化試驗和掃描電鏡技術(shù)鑒定符合申克孢子絲菌的真菌學(xué)特征；
　　 2.臨床耐藥株均能擴增出400～600bp左右的rDNA ITS區(qū)域片段,所有片段的測序結(jié)果經(jīng)序列比對,與申克孢子絲菌的模式菌株具有99％～100％同源性；
　　 3.臨床耐藥株在酵母相的伊曲康唑

7、單藥藥敏結(jié)果顯示較高的MIC值,均達到2μg/ml。臨床耐藥株與敏感株兩組在酵母相的伊曲康唑單藥藥敏MIC值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.02),而菌絲相則無差異(P=0.119>0.05)；兩組的特比萘芬單藥藥敏結(jié)果無論酵母相和菌絲相均無差異；
　　 4.聯(lián)合藥敏MIC值均明顯低于單藥藥敏MIC值。兩藥聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示在菌絲相耐藥株和非耐藥株均無相關(guān)作用,在酵母相中有2株菌的FICI結(jié)果顯示聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用,其余則表現(xiàn)為無相關(guān)

8、作用和拮抗作用。其中臨床耐藥株SUMS0382在酵母相的伊曲康唑和特比萘芬聯(lián)合藥敏FICI為0.375,顯示了兩種藥物的協(xié)同作用并與臨床療效一致。
　　 5.采用BioNumerics v.4.61軟件應(yīng)用Jaccard和Dice方法對OPBG14和OPBG19引物擴增的所有申克孢子絲菌菌株的RAPD帶型進行聚類分析,結(jié)果顯示國內(nèi)不同地區(qū)來源的申克孢子絲菌基因帶型呈現(xiàn)多樣性,臨床耐藥株與敏感株在RAPD帶型及分組上未發(fā)現(xiàn)明顯聚類

9、現(xiàn)象；不同臨床類型及不同部位分離的申克孢子絲菌其帶型及分組無明顯的聚類現(xiàn)象；
　　 6.通過PCR方法采用所設(shè)計的引物擴增獲得與耐唑類藥物基因相關(guān)的申克孢子絲菌編碼細胞色素P-450羊毛固醇14α-脫甲基酶的基因序列片段,與白念珠菌ERG11基因的序列片段比對結(jié)果顯示具有高度一致的同源性。
　　 結(jié)論:
　　 1.從伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者皮損中分離的4株臨床耐藥株經(jīng)真菌形態(tài)學(xué)特征、轉(zhuǎn)化實驗、電鏡和rDN

10、A ITS序列分析鑒定為申克孢子絲菌；
　　 2.采用M38-A方案和改良M27-A2藥敏試驗方案進行的申克孢子絲菌菌絲相和酵母相體外單藥藥敏和聯(lián)合藥敏試驗中臨床耐藥株在致病相酵母相對伊曲康唑高MIC結(jié)果證明其耐藥性；
　　 3.申克孢子絲菌耐藥株的伊曲康唑和特比萘芬體外藥敏試驗的聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示具有協(xié)同作用且與相對應(yīng)的臨床療效一致,體外聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果對指導(dǎo)聯(lián)合治療具有一定臨床意義；
　　 4.國內(nèi)不同地區(qū)來源