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文檔簡介
1、第一部分人類腸道病毒分子生物學分型鑒定方法的建立及應用。 人類腸道病毒(HEV)是小核糖核酸病毒科的一個屬,文獻報道的HEV已有91個型,分為脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組、B組病毒、??刹《竞托滦湍c道病毒5個組。人類腸道病毒感染大多表現(xiàn)為隱性感染或癥狀輕微,但也可以引起無菌性腦膜炎、弛緩性麻痹、急性心肌炎、手足口病等嚴重疾病。常規(guī)的HEV鑒定多采用病毒分離結(jié)合中和試驗等血清學方法,由于HEV血清型繁多,血清學分型鑒定費時費力。本研
2、究的目的在于建立人類腸道病毒分子生物學分型鑒定方法,用于臨床分離腸道病毒的分型鑒定。 根據(jù)已知各型別人類腸道病毒基因的核苷酸序列和文獻資料,分別合成1對HEV種屬特異性引物“EV1/EV2”和5對分型鑒定引物“P1/P2”、“P1/P3”、“P4/P7”、“P5/P7”和“P6/P7”,提取病毒RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增病毒cDNA,通過瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析,建立了人類腸道病毒的分子生物學分型
3、鑒定方法。采用該方法鑒定了18株疑似HEV毒株,并與血清中和試驗相互驗證。結(jié)果表明,經(jīng)種屬特異性引物鑒定,其中17株為人類腸道病毒;采用型特異性引物進行分型鑒定,其中4株為科薩奇病毒A24型,3株為科薩奇病毒B3型;科薩奇病毒B2、A9、A15型、??刹《?、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株,微量中和試驗結(jié)果與分子生物學方法分型結(jié)果完全符合。 本實驗組合運用了上述6對HEV鑒定和分型引物,對全部引物的PCR擴增體
4、系和擴增條件進行了統(tǒng)一,可以顯著節(jié)約病原學檢出時間,同時可以確定流行株可能發(fā)生的基因變異情況,與傳統(tǒng)的病毒分離和血清學鑒定分型方法相比具有特異性強、敏感性高、快速簡便等優(yōu)點,可以直接鑒定并分型診斷人類腸道病毒感染,適用于人類腸道病毒感染的實驗室診斷和流行病學研究。 第二部分乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建。 慢性乙型肝炎是一種嚴重的病毒性疾病,雖然近年來抗HBV治療有了很大進展,但由于治療性藥物難以徹底清除乙型肝
5、炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),而且具有停藥易復發(fā),易引起病毒變異等缺點,所以打破慢性乙肝患者對HBV的免疫耐受,提高特異性免疫功能目前被認為是有望徹底治愈HBV慢性感染的根本措施。本實驗以HBVHBc作為免疫呈現(xiàn)載體,選取畢赤巴斯德酵母(Pichia.pastoris)外源基因表達系統(tǒng)表達乙型肝炎病毒不同免疫表位嵌合抗原,以期用于治療慢性乙肝患者,增強乙肝病毒各抗原表位的免疫原性和抗原性,打破耐受、重建免疫應答,激發(fā)
6、慢性乙肝患者體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體和以細胞毒性T細胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)應答為主的細胞免疫應答,以達到清除肝細胞內(nèi)病毒的目的。 本實驗選取adr亞型乙肝病毒DNA作為擴增模板,擴增獲得編碼HBV核心抗原(HBVcoreantigen,HBc)1-78aa、HBc79-149aa、preS1抗原10-50aa、preS2抗原110-154aa及S抗原101-157aa的五個基因片段。通過將HBc1-78a
7、a和HBc79-149aa兩個基因片段酶切連接并插入質(zhì)粒pPIC3.5k構(gòu)建了以HBc為呈現(xiàn)載體的酵母表達質(zhì)粒pPIC3.5kHBc。將擴增獲得的preS1、preS2和S三個基因片段插入質(zhì)粒pGEM-T/HBc2獲得融合基因片段S1C、S2C和SC,之后將融合基因片段插入質(zhì)粒pPIC3.5k,構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒pPIC3.5kHBcS1、pPIC3.5kHBcS2和pPIC3.5kHBcS。 將表達質(zhì)粒pPIC3.5kHBcA
8、、pPIC3.5kHBcS1和pPIC3.5kHBcS2以SalI核酸內(nèi)切酶線形化,電穿孔轉(zhuǎn)化GS115酵母細胞,利用無氨基酸的酵母含氮堿基作為唯一氮源篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。通過G418加壓篩選,獲取了可以高效表達融合蛋白的多拷貝整合菌株。 對篩選出的多拷貝整合菌株進行甲醇利用表型鑒定,全部菌株均為甲醇利用正常型(Mut+)。對所選菌株提取酵母基因組DNA,以PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子,確定全部菌株均整合了酵母表達質(zhì)粒。 本研究
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