家蠶二分濃核病毒結構蛋白表達分析.pdf

1、家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori bidensovirus，BmBDV)是2012年國際病毒分類委員會批準新創(chuàng)建的二分DNA病毒科的唯一代表種。家蠶二分濃核病毒是引發(fā)家蠶濃核癥、造成養(yǎng)蠶業(yè)重大經(jīng)濟損失的重要病原之一。BmBDV是首例動物二分DNA病毒，病毒粒子是無囊膜的正二十面體結構，顆粒體直徑約22-24nm;BmBDV病毒基因組包括兩節(jié)段的單鏈DNA分子(VD1，6.6kb和VD2，6.0kb)分別包裝在兩種大小相同、結構相

2、近的球形衣殼中;此外，BmBDV基因組還自身編碼一個B家族的DNA聚合酶PolB。BmBDV基因組中兩個基因編碼結構蛋白質，主要結構蛋白VPs由VD1-ORF3編碼，vp gene全長1500bp，是病毒衣殼蛋白的組成成分，與BmBDV病毒粒子的包裝相關，VP蛋白的jelly-roll樣8β-strands結構域與細小病毒衣殼蛋白(CP)高度同源，NS1蛋白保守的S3H結構域也同樣暗示BmBDV起源于細小病毒。與細小病毒相比很獨特的是，

3、BmBDV還編碼病毒另一個較大的結構蛋白質---次要結構蛋白SP，sp基因全長3483bp，SP蛋白理論分子量約為133kDa，與呼腸孤病毒科質型多角體病毒BmCPV的結構蛋白VP3高度同源，主要介導病毒粒子的進入，sp基因只表達一種蛋白質、豐度很低，屬于少量的結構蛋白;而關于結構蛋白的組成和VP蛋白的表達策略仍無定論。本實驗首先通過蛋白質組學技術檢測病毒粒子完整的蛋白質表達圖譜;其次，共表達兩種結構蛋白VP和SP，解析病毒粒子結構蛋白

4、的自組裝情況;再次，通過突變vp基因的第二個起始密碼子，分析主要結構蛋白VPs的表達策略。主要結果如下:
　　1.從感病家蠶中腸組織純化的病毒粒子作為實驗樣本，通過二維電泳(2-DE)檢測完整的蛋白質表達圖譜，鑒定到六種BmBDV病毒粒子蛋白質的肽指紋圖譜，分布在分子量50-55kDa，等電點(pI)6.5-7.1之間;再利用質譜(MALDI-TOF-MS)分析所獲得的蛋白質表達圖譜，這6個結構蛋白都是由主要衣殼蛋白基因vp ge

5、ne編碼的。與VPs蛋白的理論等電點相比，觀測值明顯發(fā)生酸性偏移，二級質譜(MS/MS)解析還發(fā)現(xiàn)VP蛋白的Met163處發(fā)生了氧化修飾。該結果首次較為全面地揭示了結構蛋白的組成情況。
　　2.利用桿狀病毒(Multibac)表達系統(tǒng)，共表達病毒粒子兩種結構蛋白---VPs和SP。將構建的重組病毒Multibac-vp-sp感染Spodoptera frugiperda(sf9)細胞，Western blot檢測到兩種結構蛋白條帶

6、VPs(3種，50-55kDa)和SP(1種，133kDa)，透射電鏡(TEM)觀察經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化的VP和SP蛋白表達產(chǎn)物，可見自組裝的直徑22-24nm的病毒樣粒子顆粒VLPs。
　　3.通過基因定點突變技術將vpgene第二個起始密碼子AUG突變后的編碼序列插入AcMNPV桿狀病毒表達系統(tǒng)，感染昆蟲細胞，在polh啟動子的調控下重組表達VP2STm蛋白，Western blot未檢測到起始于第二個起始密碼子表達的結構蛋