30333.帽兒山地區(qū)異色瓢蟲(chóng)不同色斑型的srap與issr分析

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號(hào)：09020學(xué)位論文帽兒山地區(qū)異色瓢蟲(chóng)不同色斑型的SRAP與ISSR分析指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：程琳遲德富教授碩士20094東北林業(yè)大學(xué)東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專(zhuān)業(yè)：森林生物工程論文答辯日期：20096授予學(xué)位日期：20096答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：春多厶櫛素大學(xué)摘要摘要異色瓢蟲(chóng)(HarmoniaaxyridisPallas)主要分布于亞洲大陸，是一種在廣泛的地理分布上具有高度多型性的

2、瓢蟲(chóng)，學(xué)術(shù)界存在多種命名方法。本研究在完成材料DNA提取的基礎(chǔ)上，對(duì)60種不同色斑型異色瓢蟲(chóng)材料進(jìn)行了SRAP和ISSR分子標(biāo)記，用篩選出的多態(tài)性較好的15對(duì)SRAP引物和15個(gè)ISSR引物組合對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增和標(biāo)記分析。結(jié)果表明：(1)總DNA的提取采用CTAB法，并加以改進(jìn)。改進(jìn)后從異色瓢蟲(chóng)中所提取的總DNA得率和純度較高，能滿(mǎn)足PCR反應(yīng)的需要。(2)首次將SRAP技術(shù)及ISSR技術(shù)應(yīng)用于多種不同色斑型異色瓢蟲(chóng)中，分別建立了最優(yōu)

3、SRAP—PCR和ISSRPCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。SRAP反應(yīng)體系，即在20“L的體系中：1xBuffer，M彭0625mmol／L，dNTPs015mmol／L，引物025gmol／L，DNA50～100ng，Taq酶15U；共40個(gè)循環(huán)；前5個(gè)循環(huán)為94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸1mira后35個(gè)循環(huán)僅將復(fù)性溫度升為503℃；最后72℃延伸7min。ISSR反應(yīng)體系，即在20此的體系中：1xBuffer，M9

4、2125mmol／L，dNTPs02mmol／L，引物O15lamol／L，DNA100～150ng，Taq酶1U；共35個(gè)循環(huán)，94℃變性30S，533℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。(3)對(duì)60份供試材料提取的基因組DNA，篩選出多態(tài)性較好的15對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出326條帶，多態(tài)性帶計(jì)214條，多態(tài)條帶比率為6564％，遺傳相似系數(shù)變幅范圍在04488～07008；篩選出多態(tài)性較好的15個(gè)ISSR引物

5、共擴(kuò)增出215條帶，多態(tài)條帶計(jì)201條，多態(tài)條帶比率為9349％，遺傳相關(guān)系數(shù)變幅范圍在0449406966。(4)多態(tài)位點(diǎn)比率(P)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Nei指數(shù)(H)和Shannon指數(shù)(，)所揭示的兩個(gè)底型組遺傳多樣性水平基本一致，均為黃底黑斑型遺傳多樣性高，與兩者數(shù)值統(tǒng)計(jì)相符。(5)從60份供試材料SRAP和ISSR以及兩者聚合所得的數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子聚類(lèi)樹(shù)狀圖可知，兩種標(biāo)記都可較好的把材料區(qū)分開(kāi)來(lái)，大多數(shù)相同數(shù)量斑點(diǎn)的種類(lèi)和

6、同底色型都能夠聚在一起，如黃底斑型：十八斑變型42號(hào)和十八斑變型43號(hào)、十九斑變型48號(hào)和50號(hào)、十九斑變型45號(hào)和46號(hào)、十六斑變型36號(hào)和39號(hào)、四斑變型4號(hào)和6號(hào)、八斑變型14號(hào)和16號(hào)都聚為一組；黑底斑型：重名變種與鮮明變型、眼斑變型和雙月斑變型分別聚為一組，這些結(jié)果與形態(tài)分類(lèi)一致。(6)研究表明SRAP和ISSR的聚類(lèi)分析結(jié)果存在差異。對(duì)兩種方法進(jìn)行的相關(guān)性分析表明，他們之間仍存在極顯著相關(guān)性。在對(duì)兩種標(biāo)記復(fù)合聚類(lèi)與單一聚類(lèi)的