2014年--遺傳學外文翻譯--早期和晚期人體惡性腫瘤中循環(huán)腫瘤dna的檢測（譯文）

1、<p><b>　　中文7530字</b></p><p>　　出處：Chetan B, Mark S, Leary R J, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.[J]. Science Translational Medicine, 2014,

2、 6(224):1066-1072.</p><p>　　早期和晚期人體惡性腫瘤中循環(huán)腫瘤DNA的檢測</p><p>　　如何發(fā)展無創(chuàng)的方式去發(fā)現(xiàn)和監(jiān)視腫瘤一直是腫瘤學中的一個主要挑戰(zhàn)。我們在640位有著不同種癌癥的患者身上采用基于數(shù)字化PCR的技術(shù)去評估腫瘤循環(huán)DNA (ctDNA) 探測癌癥的能力。我們發(fā)現(xiàn)>75% 有著晚期胰腺，卵巢，結(jié)腸，膀胱，胃，乳腺，黑色素，肝細胞或頭頸

3、部癌癥的患者體內(nèi)的ctDNA是可探測的，但是只有不到百分之五十患有原發(fā)性腦，腎，前列腺或甲狀腺癌的患者中可探測到ctDNA。在有著局部腫瘤的患者中，結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌ctDNA的可探測率分別是73%, 57%, 48%和50%。ctDNA經(jīng)常出現(xiàn)在沒有循環(huán)腫瘤細胞的患者中，暗示這兩種生物標記物是不同的存在。在有著206名轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的一組單獨實驗對象中，我們發(fā)現(xiàn)有臨床相關(guān)KARS基因突變的ctDNA可探測率是87.2% ，

4、且特異性是99.2% 。最終，我們在24位對治療有著客觀響應但隨后復發(fā)的患者身上對ctDNA是否能夠提供表皮生長因子受體抑制劑潛在抗性機制的線索進行評估，這些患者中的23人(96%) 在涉及促分裂原活化蛋白激酶通路的基因中發(fā)展出一個或更多的突變?？傊?，這些數(shù)據(jù)暗示ctDNA是一個明顯適用的，敏感的</p><p><b>　　簡介</b></p><p>　　在美國，

5、癌癥今年就會發(fā)生在多于160萬的個體身上，但是一個經(jīng)過臨床證明的可以用來幫助指導病人管理的循環(huán)生物標記只適用于他們中的少部分，甚至是在廣泛轉(zhuǎn)移的設(shè)置中(1–6). 盡管基于血漿的蛋白生物標記比如癌抗原-125(CA-125), 癌胚抗原(CEA) 和前列腺特異性抗原(PSA) 通常用于這一目的，但這些蛋白也存在于不患癌癥的個體的血漿中，雖然濃度較低(2–4). 此外，在晚期癌癥患者體內(nèi)這些標記并沒有被發(fā)現(xiàn)相當大程度的增加(5, 6)。&

6、lt;/p><p>　　隨著負責人體癌癥產(chǎn)生和發(fā)展的基因改變的發(fā)現(xiàn)，尋找新一代生物標記成為了可能(7–11) 。隨著源自近來癌癥基因測序研究的基因信息的匯總，現(xiàn)在已知幾乎每一種癌癥都有體細胞基因改變。這些改變包括單堿基替換，插入，刪除和易位（后者包括那些與基因融合，基因擴增或雜合性缺失的產(chǎn)物）。這些體細胞突變以可忽略的頻率發(fā)生在普通細胞群體中并因此提供從生物學視角上坎精巧的特定生物標記。</p><

7、;p>　　有兩種腫瘤DNA可以在循環(huán)中被非侵入性的評估：無細胞腫瘤循環(huán)DNA(ctDNA)和循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）(12, 13)。ctDNA 由與細胞或細胞碎片無關(guān)的核酸小碎片組成。相反，CTCs展現(xiàn)著完整，經(jīng)常是存活的，可通過物理化學特性或者區(qū)別于其他普通血細胞的細胞表面分子從血液中純化的細胞(15) </p><p>　　盡管只有少量的研究比較過同一病人體內(nèi)的CTCs數(shù)量和ctDNA模板(16–19

8、)，但許多研究已經(jīng)表明ctDNA和CTCs都出現(xiàn)在晚期腫瘤中。比較這兩種的方法的研究出現(xiàn)了相反的結(jié)論，很可能是因為技術(shù)問題限制了對ctDNA 或CTC成分的理解。此外，盡管ctDNA真的可能來自CTCs，但是ctDNA 或CTC釋放入循環(huán)系統(tǒng)的機制尚不明確。這一研究的目的之一就是對同一病人采用無偏倚方法后比較ctDNA 和 CTCs在循環(huán)中的含量。</p><p>　　至今大部分ctDNA的研究各自評估有著單型腫

9、瘤的患者。鑒于這些研究中DNA的準備和分析技術(shù)有著顯著的不同，所以很難去直接比較不同腫瘤類型ctDNA的含量(16, 20–26) 。因為數(shù)據(jù)報道形式的不同，研究間的比較同樣也很有挑戰(zhàn)性。舉例來說，比較實時聚合酶鏈式反應的結(jié)果和那些評估突變模板分子碎片的結(jié)果是幾乎不可能的，或者用基于血清分析的結(jié)果去比較基于血漿分析的結(jié)果，也同樣不可能。為了直接比較不同類型的癌癥和為了確定臨床應用ctDNA測量有效的癌癥的光譜，我們在當前研究中評估了大量

10、類型的癌癥。我們對所有樣品使用標準化指南提純血漿和腫瘤DNA并使用數(shù)碼技術(shù)評估每種腫瘤的ctDNA水平，從而使我們能夠報道每個案例每毫升血漿的突變模板數(shù)(Fig. 1).這個方法也可以使我們直接比較兩種在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的最常見的腫瘤特異性遺傳學變化形式：單基因替換和重排。</p><p>　　CtDNA最直接的應用之一被術(shù)語化為“液體活組織檢查” (20). 在研究和臨床實踐中，很難獲得用于基因分析的腫瘤樣本。一些腫

11、瘤（比如肺癌）只有通過細針穿刺才能得到并不足夠用于基因型分析的材料，反之在其他情況下從不同醫(yī)療中心獲取樣本會很有挑戰(zhàn)性或者很耗時(27). 此外，一旦一個靶向治療用于有著多種轉(zhuǎn)移瘤的病人，臨床醫(yī)生可以經(jīng)常尋找復發(fā)的早期證據(jù)或者潛在抗性的機制，這是一種液體活組織檢查特別有價值的情況。例如，他們可以提供全部腫瘤負荷的暫時性測量值和識別治療期間上升的特異性基因突變(16, 20, 21, 23, 28, 52). 盡管液體活組織檢查的方式證明

12、是有前途的，但它相關(guān)于傳統(tǒng)腫瘤活組織檢查的敏感性和特異性并沒有在一個大的臨床相關(guān)群組中被評估。這里，我們在使用表皮生長因子受體抑制劑結(jié)腸癌患者(CRCs)身上評估這一方法的特異性和敏感性。我們也使用液體活組織檢查的方法在最初應答表皮生長因子受體抑制劑的患者身上鑒別負責復發(fā)的的基因突變?？偟膩碚f，對ctDNA測量用于評估有不同癌癥的患者，這些研究提供了其潛在價值與局限的豐富信息。</p><p><b>

13、　　結(jié)果</b></p><p><b>　　有著轉(zhuǎn)移癌的患者</b></p><p>　　我們從評估來自14種不同組織類型的136例轉(zhuǎn)移癌和41位有著原發(fā)性腦腫瘤（神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)管細胞瘤）的患者開始這項研究。原發(fā)性腦腫瘤被包括在這項評估內(nèi)是因為盡管它幾乎不轉(zhuǎn)移但它通常是致命的。我們同樣也包括了10例額外的案例，由三期卵巢癌（n=7）和肝細胞癌（n=3

14、）組成，這個特別的評估是因為四期案例非常稀有并且在這兩種癌癥中三期疾病更具有晚期腫瘤的代表性。這些患者的臨床特征被總結(jié)為表一。靶向測序，外顯子測序或全基因組測序被用來識別癌癥中的基因突變，就像輔助材料及方法中描述的那樣。在這些晚期案例中，至少一個基因改變—一個點突變（151例）或者基因重排（36例）—被發(fā)現(xiàn)在每一個癌癥研究者中(S1表)。除了在KRAS, NRAS, PIK3CA, 和BRAF（眾所周知體細胞中的） 這些已知熱點基因中發(fā)

15、生基因突變的子集外 ，通過評估同一患者非腫瘤性細胞的DNA，所有其他基因突變被證明也發(fā)生在體細胞中。ctDNA通過三種數(shù)字化方法中的一種進行評估（見補充材料和方法）。當應用于同一血漿樣本，這些方法產(chǎn)生了可比較的結(jié)果（圖s1）并且從5ml血漿提純的DNA中全部可以探測到一個突變模板。每個病人的可</p><p>　　大部分有著腦外實體瘤的被研究患者被檢測到ctDNA(112/136; 82%). 然而，有著可探測c

16、tDNA的部分患者因腫瘤種類而異(似然比檢驗, P < 0.001). 如圖2A和圖S2所示，大部分有著三期卵巢癌，肝癌和胰腺，膀胱，結(jié)腸，胃，乳腺，肝臟，食道和頭頸部轉(zhuǎn)移癌，以及成神經(jīng)細胞瘤和和黑色素瘤的患者有著可探測水平的ctDNA。相反，少于50%有著成神經(jīng)管細胞瘤或腎臟，前列腺，甲狀腺轉(zhuǎn)移瘤的患者和少于百分之十有著神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者有可探測水平的ctDNA。有著圖2A描述的腫瘤類型的患者數(shù)量是很少的，這限制了不同類型腫瘤間比

17、較的統(tǒng)計學意義，但有著神經(jīng)膠質(zhì)瘤（低或高水平，表S1）的患者相比有著胰腺，結(jié)腸，乳腺，食管/胃或者卵巢轉(zhuǎn)移癌的患者更低可能有ctDNA（圖2A和圖S2）。</p><p>　　盡管ctDNA在大部分有著轉(zhuǎn)移癌的患者中是可檢測的，但ctDNA的濃度因病人而異，甚至是在那些同種類癌癥中（圖2B和表S1）。有些這種變率是因為在不同腫瘤中化驗基因的拷貝數(shù)是不一樣的。舉例來說，如果患者A腫瘤中的待測基因放大50倍，然而患者

18、B腫瘤中的待測基因呈現(xiàn)正常的拷貝數(shù)，那么患者A的ctDNA量預期是患者B的50倍（見“ctDNA中單堿基替換與重排的比較”）。然而，在只有非放大基因(例如 TP53) 被評估的癌癥中觀測到很大程度的變異性。</p><p><b>　　有著局部疾病的患者</b></p><p>　　我們下一步評估有著局部疾病患者體內(nèi)的ctDNA，就是說，在樣本采集期間沒有臨床上或者放

19、射線檢查的遠端轉(zhuǎn)移證據(jù)。在有著所有被評估種類局部癌癥的233名患者中，55%患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)可探測水平ctDNA（233名患者中的122名，表S1）。這部分低于來自所有腫瘤類型有著充足可用樣本的轉(zhuǎn)移性疾病患者（乳腺，結(jié)腸，胰腺和胃食管；圖3A；模型擬合及分層卡方檢驗；P < 0.001 ）的觀測值?？蓹z測水平ctDNA出現(xiàn)在49%到78%有著這四種局部腫瘤的患者中以及86%到100%有著這四種轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者中（圖3A）。</p

20、><p>　　有著可探測水平ctDNA患者比例的不同也與病程有關(guān)：47%一期任何癌癥的患者有著可探測ctDNA，然而2，3，4期癌癥病人有可探測ctDNA的比例各自是55%，69%和82%（圖3B,薩默斯指數(shù)等級相關(guān)=0.337）。同理，血漿中ctDNA濃度隨著病程上升。</p><p>　　比較ctDNA和CTCs</p><p>　　這些實驗中，DNA孤立于離心分離

21、后得到的血液中的細胞區(qū)室，這些顆粒包括CTCs和白細胞（WBCs），血小板，和其他細胞成分。在每個樣例中，腫瘤DNA的全基因組測序被用于鑒別體細胞重排。基于PCR的試驗被用于識別相同患者那些血液顆粒(CTCs) 或者血液上清液(血漿)中的重排。這些實驗可以在腫瘤特異性重排下進行但不能在腫瘤特異性點突變下進行，原因見討論。我們沒有識別到任何CTCs可探測但ctDNA不存在的案例。然而在許多ctDNA可被檢測到的情況下(1中13個; 81%

22、) ，沒有CTCs可在相同實驗中被探測(表2). 此外，在CTCs和ctDNA水平都可檢測的三個案例中，血漿中突變碎片的平均數(shù)量大于50被CTCs中的類似水平。</p><p>　　ctDNA中單堿基替換與重排的比較</p><p>　　我們也感興趣于比較同一患者的循環(huán)中兩種不同種類DNA碎片的基因?qū)W改變。盡管這項研究中實際問題使我們不能鑒別所有患者中的基因重排（見討論），但在19名患者中

23、腫瘤特異性重排和腫瘤特異性點突變被識別（表S2）。一個例外是一名在TP53有著循環(huán)點突變的患者，這名患者腫瘤中的重排鑒定不能在她的血漿中被識別（表S2）。有著點突變的循環(huán)DNA碎片的絕對數(shù)量相對重排是高度相關(guān)的（圖4；相關(guān)系數(shù)=0.96）。然而，在四名病人體內(nèi)，含有重排的循環(huán)碎片數(shù)量大于十倍含有待測點突變的循環(huán)碎片數(shù)量（表S2），這一現(xiàn)象的原因是我們選擇用來分析重排的基因在腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)基因擴增的結(jié)果，然而點突變通常在每個腫瘤基因組中只

24、出現(xiàn)一次。</p><p>　　液體活組織檢查的敏感性和特異性</p><p>　　上述結(jié)果是通過首先在腫瘤中識別基因突變?nèi)缓鬁y定血漿中是否有相同可探測突變的方法獲得的。對特定液體活組織檢查的應用，腫瘤的基因突變事先未知并且所有相關(guān)突變被馬上標為待測。為了測定液體活檢方法的敏感性，我們盲法評估206名有著轉(zhuǎn)移性CRC患者的血漿和腫瘤（表S3）。這一隊病人完全獨立于上文提及和在S1,S2表中

25、的410名病人。對每例樣本，我們界定KARS第12，13位堿基突變是否既在原發(fā)性癌又在2ml治療前抽提血漿中出現(xiàn)。KARS基因被選中用于這一研究是因為它的臨床相關(guān)性；在原發(fā)性腫瘤中KARS基因突變的出現(xiàn)是使用抗體抑制EGFR來治療轉(zhuǎn)移性CRC患者的先決條件(29)。我們識別了69名患者在血漿中有著循環(huán)突變KARS(206人中的33%) 。128名有著KARS野生型癌癥的患者中127人沒有被檢測出循環(huán)KARS突變，得出未修正的特異性99.

26、2%。在69例血漿樣本中鑒別到的基因突變與腫瘤中鑒別到的完全相同，進一步強調(diào)了液體活組織檢查的特異性。除了這69例腫瘤，我們鑒別了10例（206例中）基因突變出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤但不在血漿中的樣本，得出敏感度是87.2% 。在血漿和腫瘤組織中KARS突變狀</p><p>　　為了更好地理解觀測到的假陰性結(jié)果，我們下一步評估了26個臨床和病理學特點，（表S3和S4）。與假陰性ctDNA結(jié)果（腫瘤中有KARS基因突變但

27、是血漿中沒有可探測基因突變）相關(guān)的的現(xiàn)象是低CEA水平，黏蛋白組織學，低水平丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，WBC數(shù)量少，和更年輕（表S4和S5）。CEA水平也顯然與血漿中突變KARS碎片濃度有關(guān)（表S6與S7）。低腫瘤負荷（從通常CEA水平中體現(xiàn)）與低ctDNA水平相關(guān)的這一想法與觀測值是一致的。</p><p>　　我們下一步檢測ctDNA濃度與存活率的關(guān)系。從一個有著已知預后因素（年齡，東部腫瘤協(xié)作組ECOG體力狀況PS，和

28、CEA）的模型開始,并假設(shè)這些評估變量是線性的，我們發(fā)現(xiàn)ctDNA濃度為預測存活提供了附加價值（似然比檢驗，P=0.00253,df=3）。隨后我們評估不同ctDNA水平的兩年存活率，包括其他預測變量（圖5）。我們觀測到隨著ctDNA濃度的上升存活率穩(wěn)定下降</p><p>　　檢測患者的抗性獲得基因突變</p><p>　　液體活組織檢查同樣可用來監(jiān)控靶向藥物治療的患者，提供復發(fā)的早期預

29、警和抗性的遺傳學基礎(chǔ)的信息。舉例來說，KARS第12，13位密碼子突變出現(xiàn)在24名患者中的38%，這些患者最初響應了EGFR抑制劑但隨后疾病進展（20）。在每個案例中，KARS基因突變沒有出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中但推測起來產(chǎn)生在轉(zhuǎn)移病灶的少量細胞中，并在EGFR抑制劑的影響下擴散。這里我們希望確定除了在KARS12，13堿基處的突變外，是否有其他的抗性突變可以在EGFR抑制劑治療患者的液體活組織檢查中發(fā)現(xiàn)。我們因此設(shè)計了一個多路，基于測序化驗

30、去檢測EGFR通路幾個基因中的已知突變熱點：在KARS 第12，13，59，60和61堿基位點內(nèi)和周圍的區(qū)域；NARS第12，13，59，60和61堿基位點；BRAF 第599和600堿基位點；EGFR第 712至721，738，748，790至800，和847至895堿基位點；以及PIK3CA第538至549和1039至1050堿基位點。24個被評估的案例中包括17個之前評估過KARS基因突變的案例（20）和7個額外的患者使用EGFR

31、抑制抗體治療，最初應答但隨后病程進展的案例（帕尼單抗或西</p><p>　　在24名患者中我們識別到23人（96%）在胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路基因有著至少一個自發(fā)的循環(huán)突變。每個患者的循環(huán)中識別到的不同突變數(shù)平均值為2.9（區(qū)間0-12）.同一患者中不同突變的的發(fā)展為自身的多發(fā)性病變是并不奇怪的；每種響應EGFR阻斷劑的病變被期望擁有至少一個耐藥性突變（20,30）.</p><p>　　總

32、共，我們觀察到70例在使用EGFR阻斷劑之前沒有腫瘤或者血漿中檢測到的體細胞突變，只出現(xiàn)在治療開始之后（表S8和圖6）.一般的突變（70中的34例）出現(xiàn)在KARS第12密碼子。當這些突變出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中被認為導致了EGFR阻斷劑的抗性，并被觀察到使用EGFR阻斷劑后水平提高不論是在體內(nèi)還是體外（20,30）。BARF中的一個突變被觀察到。之前的幾項研究表明BRAFV600E突變，當出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中時，與無法響應EGFR阻斷劑相關(guān)（3

33、1-33）。兩個其他患者在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)突變（密碼子714和794，表S8和圖6）。這些篩留物中的突變之前在原發(fā)性CRC中被觀測到，雖然并不經(jīng)常，同時EGFR阻斷劑的抗性顯示是由EGFR基因遺傳學改變所導致（34,35）。我們沒有識別在已知PIK3CA基因熱點的治療相關(guān)突變（外顯子9和20）（36）</p><p>　　我們研究組成中最讓人驚訝的EGFR阻斷劑觀察是KRAS或NRAS基因61位密碼子的大量

34、突變（表S6和圖6）.24位患者中的15人（62.5%）擁有至少一個61位密碼子突變，這15位患者擁有所觀測到的總計31個突變的百分之45（69），48%的61位密碼子突變出現(xiàn)在NRAS其余在KRAS中（表S6和圖6）.</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　通過所研究的640位患者，我們發(fā)現(xiàn)突變DNA碎片相對較多的集中在轉(zhuǎn)移性癌癥中被發(fā)現(xiàn)，以

35、及在大部分有著局部癌癥的患者中有著較低但是可探測的水平。這些結(jié)果有著多種可解讀的含義以及為將來的研究建議了重要的途徑。</p><p>　　檢測晚期癌癥患者的疾病</p><p>　　一個遺傳性改變可以在這部分研究評估的所有410位患者的腫瘤中被識別，使得ctDNA對癌癥患者來說是一個可廣泛應用的生物標記。此外多于80%有著轉(zhuǎn)移性疾病的患者有著可探測水平的ctDNA，高于大部分有記錄的常用

36、生物標記（37）.與既在普通細胞又在腫瘤細胞中表達的CEA或者CA19-9蛋白質(zhì)不同，克隆性的遺傳學改變只出現(xiàn)在腫瘤中。我們的數(shù)據(jù)指出ctDNA的測量同樣可以提供有著轉(zhuǎn)移性癌癥患者的治療方法，預測以及預后方面的信息。如圖5所示，有著相當?shù)退絚tDNA的轉(zhuǎn)移性CRC患者比高水平患者的壽命顯著延長，并且在ctDNA濃度和存活率間有著顯著相關(guān)性。一個存活率與ctDNA濃度間類似的相關(guān)性最近在晚期乳腺癌患者中被報道（16）。</p>

37、;<p>　　盡管ctDNA這些優(yōu)點使得它對于監(jiān)控患者是很有前途的，但也有潛在的局限性。特異的突變被原發(fā)性癌癥的評估所界定，對于患者的管理既需要投入時間也需要費用。將來這會變得阻礙更小，因為更多的癌癥患者將會對他們的腫瘤進行遺傳學分析以便于指導治療決定。這些過去常常用于指導治療的遺傳學改變同樣可被用于ctDNA分析。涉及監(jiān)控晚期癌癥患者的實用性的一個更嚴肅的問題是，使用ctDNA還是生物標記（38，39）。一方面，患者和他

38、們的內(nèi)科醫(yī)生焦急地想盡快知道疾病是否進展。設(shè)想研究經(jīng)常是無告知性的或者遲鈍的反應疾病進展。再設(shè)想受試患者受到輻射，但是ctDNA的監(jiān)測是非侵入性的。另一方面，尚未顯示使用任何生物標記監(jiān)控晚期癌癥患者在臨床上有著類似于對心理效益的不利。在轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床癥狀前知道進展（或應答）可能并不會延長生存或提高生命質(zhì)量。</p><p><b>　　方法論的比較</b></p><p>

39、;　　血液中有兩類可獲得的腫瘤DNA（CTCs和ctDNA），兩種類型的遺傳學改變可以在任一類型中很容易的被評估（點突變和易位）。早先比較ctDNA與CTCs的研究得到了混合的結(jié)論。舉例來說，一個小組得出ctDNA的出現(xiàn)少于CTCs的結(jié)論（17）；這一組使用體現(xiàn)最高技術(shù)水平的方法去探測CTCs但是并沒有使用高敏感性的方法去探測ctDNA。第二組得出的結(jié)論是ctDNA比CTCs更經(jīng)常的出現(xiàn)（16）；這一組使用一種靈敏的方法去分析ctDNA

40、但是使用了幾乎不敏感的方法去探測CTCs。最近以來，在三名小兒成神經(jīng)細胞瘤患者中的兩位發(fā)現(xiàn)ctDNA的水平遠高于CTCs（19）。</p><p>　　為了進一步研究這個問題，我們對來自有著典型實體瘤患者的同一血液樣本同時評估ctDNA與CTCs。我們僅把細胞性成分與血漿分離并鑒定細胞部分或細胞類似物，分別的，這其中的腫瘤特異性重排可以被鑒定。因為我們沒有試圖事實上從普通白細胞計數(shù)中分離腫瘤細胞，關(guān)系到CTC純化

41、效率的技術(shù)問題被排除。來自CTCs和ctDNA的DNA間的比較并不能簡單地通過點突變來展現(xiàn)，因為基于PCR實驗的點突變背景水平很高。這一背景妨礙了每十萬細胞少于一個水平的點突變的探測。因為每毫升血液中出現(xiàn)有幾百萬普通細胞但只有幾個CTCs，需要一種更靈敏的技術(shù)。重排的探測很適合這一任務(wù)，因為據(jù)顯示在數(shù)百萬野生型模板分子中一個突變可以被穩(wěn)定的探測；PCR錯誤并不會形成特定的重排。</p><p>　　使用患者特異性

42、重排作為工具，我們能夠顯示ctDNA的水平總是高于CTCs。在16名患者中的13人的ctDNA水平非常高但是沒有任何CTCs可以被檢測到。這并不意味著ctDNA相對于CTCs更適合于檢測或監(jiān)控癌癥。不如說最理想的技術(shù)取決于許多其他因素，包括費用與生產(chǎn)力，這樣CTC探測有優(yōu)勢。然而，這些比較確實顯示絕大多數(shù)ctDNA并不是直接從CTCs中產(chǎn)生的。因為ctDNA的半衰期很短（小于1.5小時），事實上比CTCs短(43)，我們的工作顯示血漿中

43、的變異分子并不是從CTCs中產(chǎn)生的。</p><p>　　另一個比較的興趣點關(guān)注于易位和點突變。我們的結(jié)果（表S2）顯示研究的案例中每毫升血漿ctDNA碎片中易位和點突變的數(shù)量是相似的。然而，在19個案例中的1個，一個點突變在血漿樣本中被探測到但是所研究的易位是缺失的。這一現(xiàn)象可能的原因是點突變非常早的發(fā)生于腫瘤形成驅(qū)動基因中，反之重排是亞克隆性的，可能并沒有貢獻于腫瘤的發(fā)展。在四個其他案例中，重排被探測到高于點

44、突變的十倍水平（表S2）。在這些案例中，重排被發(fā)現(xiàn)是體細胞擴增基因的一部分。</p><p>　　從一個實際的角度出發(fā)，這些數(shù)據(jù)顯示如下的結(jié)論：通過使用出現(xiàn)擴增子的重排來探測遺傳學改變可達到最大靈敏度。許多腫瘤，尤其是有著這些擴增子的晚期腫瘤使得使用低覆蓋率（10x）基因組測序的方法來探測是非常簡單的。正如CTCs與ctDNA間的比較一樣，這一較高靈敏度并不意味著臨床應用上重排比點突變更受歡迎。</p>