銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫產(chǎn)生抗性的機(jī)理研究.pdf

1、銹赤扁谷盜是世界經(jīng)濟(jì)儲(chǔ)糧害蟲，極易產(chǎn)生磷化氫抗性。然而，該物種分子信息的缺乏一直是人們探究此物種磷化氫抗性產(chǎn)生機(jī)制的瓶頸所在。因此，我們采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)銹赤扁谷盜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序，以獲取更多的銹赤扁谷盜基因信息資源，為其磷化氫抗性機(jī)理研究奠定分子基礎(chǔ)。主要研究成果如下：
　　1.本試驗(yàn)銹赤扁谷盜試蟲有蘇州張家港，四川成都和蘇州太倉品系，其LC50值分別為0.079mg/L、0.126mg/L、19.904mg/L

2、。按照聯(lián)合國給出的敏感品系LC50值比對(duì)可以得到各個(gè)品系的Rf值：ZJGCF的Rf值為7；CDCF的Rf值為12；TCCF的Rf值為1809。
　　2.通過Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出4,625,016,480的數(shù)據(jù)。組裝結(jié)果得到總長度為51,214,942bp共47,006個(gè)Unigene，其中有28,491，14,036，23,667，21,320，12,576，14,930個(gè)unigene能夠分別注

3、釋到Nr，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO數(shù)據(jù)庫。預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS），比對(duì)到蛋白庫的CDS有28,658個(gè)，預(yù)測(cè)出的CDS有5,973個(gè)，共34,631個(gè)。
　　GO功能分類，共得到115,410個(gè)功能注釋。3個(gè)ontology大類中，生物過程組最大，主要參與細(xì)胞加工和單細(xì)胞有機(jī)體加工。其次是細(xì)胞組分，以細(xì)胞、細(xì)胞的部分以及細(xì)胞器為主；分子功能組注釋最少，基因數(shù)量較多的兩個(gè)亞功能分類是結(jié)合能與催化活性。CO

4、G數(shù)據(jù)庫將注釋到的28,976條unigene分類成了25個(gè)分子家族。主要是與一般功能預(yù)測(cè)類、復(fù)制，重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄等基本的生物過程有關(guān)的基因。Pathway顯著性富集分析顯示總共有21,320個(gè)unigenes參與到258條通路上。主要富集在代謝通路，其次是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)通路。并且通過歸納整理共鑒定出4,836個(gè)SSRs和120,212個(gè)SNPs，為種群遺傳學(xué)研究提供有效工具。
　　3.通過對(duì)銹赤扁谷盜磷化氫敏感品系與抗

5、性品系的數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序，分別獲得了11.7到12.6百萬之間的clean reads。差異表達(dá)基因37,792條，包括23,802條上調(diào)基因，13,990條下調(diào)基因。其中有28個(gè)上調(diào)和26個(gè)下調(diào)共54條顯著性差異的基因（FD≤0.001且log2Ratio≥1）。GO功能分析顯示共有54個(gè)顯著富集的GO term。Pathway顯著性富集分析顯示共有36條顯著富集的Pathway。通過表達(dá)模式聚類分析進(jìn)一步將差異表達(dá)基因中功能類似的基因

6、聚類，所有的這些包含的基因很可能與磷化氫抗性密切相關(guān)。
　　對(duì)比銹赤扁谷盜磷化氫抗性品系和敏感品系的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在上調(diào)基因中注釋為表皮蛋白的基因占很大比例，研究表明其在毒性機(jī)制中通常參與調(diào)節(jié)表皮對(duì)殺蟲藥劑滲透性。下調(diào)基因中有明確功注釋的是編碼細(xì)胞色素b，ATP合成酶亞基及NADH脫氫酶亞基等蛋白質(zhì)的基因。查閱文獻(xiàn)可知上述下調(diào)基因都是線粒體中參與細(xì)胞呼吸關(guān)鍵基因。經(jīng)磷化氫長期熏蒸后，參與編碼此類基因的表達(dá)豐度顯著下降，說明磷化氫

7、抗性機(jī)制的形成與線粒體有著密不可分的關(guān)系，對(duì)其關(guān)鍵調(diào)控蛋白的研究有助于闡明磷化氫抗性機(jī)制。
　　4.將銹赤扁谷盜轉(zhuǎn)錄組的Unigenes與NCBI上Drosophial melanogaster的一支抗逆性相關(guān)基因（解毒代謝酶）進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行進(jìn)化樹分析。一共篩選出103個(gè)與解毒代謝相關(guān)的Unigene。它們是三類主要的解毒代謝酶類，包括細(xì)胞色素P450(CYP P450，68條)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs，25條）和羧酸酯酶（Ca

8、rEs，10條）。篩選出抗逆性相關(guān)基因并進(jìn)行同源性分析明確其家族分類將為后續(xù)的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也有利于闡明銹赤扁谷盜磷化氫抗性產(chǎn)生機(jī)制。
　　5.首次運(yùn)用三種算法（geNorm，NormFinder和BestKeeper）篩選出一組適用于校準(zhǔn)銹赤扁谷盜基因表達(dá)量的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。結(jié)果顯示γ-TUB+RPS13是分析不同發(fā)育階段基因表達(dá)譜的最佳內(nèi)參基因組合，SDHA+RPS13+GAPDH則是分析銹赤扁谷盜不同品