版無菌檢查法錢

1、2010版藥典無菌檢查法主要增修訂及其展望,第八、九屆藥典會(huì)微生物專業(yè)委員上海市食品藥品檢驗(yàn)所錢維清,,,,國(guó)內(nèi)外藥典微生物學(xué)檢驗(yàn) 發(fā)展的宗旨： —— 提高方法撿出率、保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。 1、 實(shí)驗(yàn)環(huán)境、設(shè)施的發(fā)展； 2、 培養(yǎng)基的品種和適用性要求； 3、 檢驗(yàn)數(shù)量、檢驗(yàn)量符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求； 4、 檢驗(yàn)方法和儀器的改進(jìn) （薄膜過濾法、全封閉過濾培養(yǎng)器） 5、 驗(yàn)證試驗(yàn)；（ICH、USP、E

2、P、BP、JP均有規(guī)定） 6、 培養(yǎng)時(shí)間； 7、 結(jié)果 的分析和判斷； 等。,回顧國(guó)際無菌檢查法發(fā)展歷史 1925年 直接接種法首先使用在英國(guó)1932年 英國(guó)藥典推薦使用無菌測(cè)試1936年 美國(guó)藥典第十一章首先引用單個(gè)培養(yǎng)基的直接接種法1950年 美國(guó)藥典第十六章推薦使用FTG和SB兩種培養(yǎng)基分別 培養(yǎng)需、厭氣 菌和真菌1957年 美國(guó)FDA和MILLIPORE公

3、司介紹膜過濾法用于抗生素?zé)o菌測(cè)試1963年 英國(guó)藥典63版收載薄膜過濾法無菌測(cè)試1965年 美國(guó)藥典引用薄膜過濾法用于非抑菌性藥品的無菌測(cè)試1971年 歐洲藥典第二版公布參照薄膜過濾法無菌測(cè)試1978年 歐洲藥典修訂版發(fā)行公布推薦使用薄膜過濾法無菌測(cè)試1988年 美國(guó)FDA規(guī)定：假如第一次無菌檢查不符合規(guī)定的樣品不再?gòu)?fù)試，這 一批次的藥品應(yīng)報(bào)廢。實(shí)際上排除了藥品無菌陽性后再測(cè)試的

4、機(jī)會(huì)1998年 英國(guó)藥典1998無菌測(cè)試以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試。2000年 美國(guó)藥典24版無菌測(cè)試以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試。,檢視我國(guó)歷版藥典無菌檢查法發(fā)展歷史 1953版 實(shí)驗(yàn)環(huán)境僅要求為半無菌操作箱；僅收載一種直接接種法； 用一種培養(yǎng)基檢查1963版 僅一種直接接種法；用三種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)菌和霉菌1977版

5、 開始收載薄膜過濾法（簡(jiǎn)單裝置），用二種培養(yǎng)基分別培 養(yǎng)細(xì)菌和霉菌1985版 收載薄膜過濾法限于抗生素樣品；用需、厭氣菌培養(yǎng)基及 霉菌培養(yǎng)基；要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境為紫外線滅菌的無菌室。1990版 與85年版相同1995版 開始要求對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢查。2000版 規(guī)定實(shí)驗(yàn)環(huán)境為100級(jí)潔凈度；

6、檢驗(yàn)數(shù)量從2支/瓶增加為 6～11支/瓶；明確薄膜過濾法為首選方法包括大容量液體樣品 首次引用、收載全封閉過濾技術(shù)。,對(duì)比國(guó)際無菌檢查發(fā)展歷史 ， 我國(guó)2000版以前藥典無菌檢查法因技術(shù)和認(rèn)識(shí)的不足，對(duì)提高方法撿出率、保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性方面的規(guī)定與先進(jìn)國(guó)家藥典中的要求嚴(yán)重脫節(jié)。,2005版無菌檢查法取得長(zhǎng)足發(fā)展 實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求 、驗(yàn)證試驗(yàn)、 延長(zhǎng)培養(yǎng)

7、時(shí)間至少為14天、以一次檢出為準(zhǔn)，取消復(fù)試等亮點(diǎn)。 是2005年版藥典無菌檢查法的大步發(fā)展，從而使2005年版無菌檢查法比歷版無菌檢查法有了突破性的提高。 基本與國(guó)際先進(jìn)藥典無菌檢查法接軌。,2010年版藥典無菌檢查法的發(fā)展，主要是在總結(jié)和鞏固實(shí)施驗(yàn)證試驗(yàn)以來所取得經(jīng)驗(yàn)及認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，作兩方面的發(fā)展： 一、附錄無菌檢查法（一部附錄ⅩⅢ B）

8、 （二部附錄Ⅺ H） （三部附錄Ⅻ A） 圍繞著保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性作進(jìn)一步的增、修訂。 二、品種各論中【無菌】各論化的發(fā)展,一、附錄無菌檢查法中的增、修訂 （一）總則部分 （二）培養(yǎng)基部分 （三）靈敏度檢查部分 （四）稀釋液、沖洗液部分 （五）方法驗(yàn)證部分 （六）薄膜過濾法部分 （七）培養(yǎng)及觀察部分 （八） 結(jié)果判斷部

9、分 （九） 表1、表2和表3,,（一）總則部分 新增規(guī)定1、“ 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。”2、“ 日常檢驗(yàn)還需要對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控?！?、“ 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。,,（二）培養(yǎng)基部分1、刪除： 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 后括號(hào)（用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌）的說明2、刪除： 改良馬丁培養(yǎng)基 后括號(hào)（用于培養(yǎng)真菌）的說明,,3、刪除： 選擇性培養(yǎng)基 項(xiàng)下加入適量中和劑

10、或表面活性劑 “ 如對(duì)氨基苯甲酸（用于磺胺類供試品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供試品）或β-內(nèi)酰胺酶（用于β-內(nèi)酰胺類供試品）”等說明。 修訂為： 在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。 增訂：表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 (見微生物限度檢查法中）,,,表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法,,4、將原排列第 6. 的 0

11、.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查） 修訂排列為第 4. ——按順序歸類培養(yǎng)基1.～4. 均為直接用于無菌檢查的液體培養(yǎng)基。,（三）培養(yǎng)基靈敏度檢查部分1、在菌液制備中，修訂黑曲霉的孢子懸液制備方法：規(guī)定應(yīng)使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子及稀釋孢子液，制成每1ml中含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。 刪除了：（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸

12、管） 吸出孢子懸液的操作方法,,2、新增加稀釋后的工作用菌液的保存條件和保存期限： 菌液制備后“若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用?！?（四） 稀釋液、沖洗液及其制備方法部分 在原有 1. 0.1%蛋白胨水溶液 2. pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖新增加：可根據(jù)供試品的特性，選用其他經(jīng)驗(yàn)證過的

13、適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。,（五）方法驗(yàn)證試驗(yàn)部分1、驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎(chǔ)上，刪除銅綠假單胞菌，增訂大腸埃希菌。 ——是因在驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗(yàn)證試驗(yàn)中對(duì)大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對(duì)抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。,2、驗(yàn)證試驗(yàn)中樣品用量的規(guī)定：刪除了原：“ 將規(guī)定量供試品按… ”修訂為 薄膜過濾法：

14、 “ 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按 薄膜過濾法過濾” 直接接種法： “接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量” —— 明確了驗(yàn)證試驗(yàn)所需樣品量是供試品的檢驗(yàn)量而不是供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。,（六）供試品的無菌檢查部分1、陽性對(duì)照用量的修訂： 原：“若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對(duì)照用?！毙抻啚?：若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品

15、量作陽性對(duì)照用?！蛉羰且后w制劑，應(yīng)該采用薄膜過濾法，若是固體制劑每管接種量可能不止1支（或瓶），應(yīng)按驗(yàn)證的方法確定。,2、薄膜過濾法中的增、修訂：2.1 新增規(guī)定：抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜2.2 新增規(guī)定：對(duì)每片濾膜的總沖洗量不得過1000ml2.3 新增規(guī)定：所用沖洗量、沖洗方法同驗(yàn)證試驗(yàn),2.4 修訂：無菌氣（噴）霧劑供試品的檢驗(yàn)方法： 規(guī)定置至少-20℃冰室冷凍1小時(shí)。并新增開啟容器

16、后 “將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中”的操作步驟。,2.5 修訂：裝有藥物的注射器供試品的檢驗(yàn)方法：刪除 原 “裝上無菌針頭（非包裝中所配帶的）” 修訂為 “取規(guī)定量，排出注射器中的內(nèi)容物，若需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解，直接過濾，” ——沒有必要將原裝配好的針頭取下來,3、 直接接種法中的增、修訂：刪除了原直接接種法中ß-內(nèi)酰胺類或黃胺類供試品項(xiàng) ?！蛟搩深惞┰嚻返臒o菌檢查以采用薄膜過濾法加

17、中和劑更好。,4、 培養(yǎng)及觀察中的增、修訂： 對(duì)于培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長(zhǎng)時(shí)，刪除了：“或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上” 的規(guī)定。必然刪除：可根據(jù)斜面是否有菌生長(zhǎng)而判斷的規(guī)定。,（七）結(jié)果判斷部分新增訂：陽性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無效。——強(qiáng)調(diào)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照在無菌檢查實(shí)驗(yàn)成立與否中的作用。,（八） 表1、表2和表3部分 表1將表1第3列的表題原 “每種培養(yǎng)

18、基最少檢驗(yàn)數(shù)量” 修訂為：“接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量” ——更明確指出接種到培養(yǎng)基中去的檢驗(yàn)量。修訂了表1下的 注: 對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍。,表2將表2原名稱：“上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)數(shù)量” 修訂為：“ 液體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”——明確液體制劑最少檢驗(yàn)量見表2的第2列，供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量見表2的第3列。 

19、3; 修訂了表2下的 注: ——對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍。,表3 ·將表3原名稱：“上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量” 修訂為：“ 固體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量” ——明確固體制劑最少檢驗(yàn)量見表3第2列；供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量見表3的第3列。·修訂了表3下的 注: ——對(duì)供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗(yàn)數(shù)

20、量應(yīng)加倍。,二、各論中【無菌】各論化的發(fā)展 舉例如下：乙酰谷酰胺注射液、丁溴東莨菪堿注射液 無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。,舉例如下：頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢哌酮鈉、頭孢硫脒、注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀、鹽酸林可霉素注射液 無菌：取本品，用適宜溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0

21、.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。氧氟沙星氯化鈉注射液 無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于500ml）每管培養(yǎng)基中加入0.1mol/L硫酸錳溶液1ml,以大腸埃希菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。,一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進(jìn)二、增加對(duì)檢出菌的檢定要求三、對(duì)每種接種后的培養(yǎng)基分別置兩種溫度（適合細(xì)菌生長(zhǎng)和適合真菌生長(zhǎng)）下

22、培養(yǎng)四、各論化中無菌檢查表述的進(jìn)一步規(guī)范化,無菌檢查法的展望,一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進(jìn),1、應(yīng)與國(guó)際先進(jìn)藥典無菌檢查法所用培養(yǎng)基保持一致 理由（1）與USP/BP/EP/JP保持一致便于國(guó)際交流。,理由（2） USP中大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基靈敏度測(cè)定要求用3種菌：枯草桿菌、白念、黑曲檢查。我國(guó)藥典改良馬丁培養(yǎng)基靈敏度測(cè)定只要求2種菌：白念、黑曲。 實(shí)驗(yàn)證明大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基同時(shí)適合真菌、

23、細(xì)菌的生長(zhǎng)，有利于提高污染菌的檢出率。,2、須進(jìn)一步深入開展無菌檢查用培養(yǎng)基的研究與開發(fā)理由（1） 無菌檢查用培養(yǎng)基曾從僅1種發(fā)展起來，且配方也逐步調(diào)整。隨著對(duì)藥品安全的保證和藥品無菌檢查要求的不斷提高，無菌檢查用培養(yǎng)基應(yīng)不斷改進(jìn)。理由（2） 任何一種培養(yǎng)基不可能把藥品中可能存在的菌都培養(yǎng)出來。,理由（3） 與培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)用菌相比較，藥品中的污染微生物會(huì)更廣泛、活性更低。 理由（4

24、） 如存在某些苛養(yǎng)菌、亞致死狀態(tài)菌——是否需要添加更豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如動(dòng)物的血液、動(dòng)物組織提取液等才能被檢出。,理由（5） 據(jù)報(bào)道：巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中指示劑刃天青對(duì)微生物有一定抑制作用，（加0.1%刃天青1ml~0.5ml對(duì)靈敏度無顯著差異。） 美國(guó)藥典中同時(shí)收載兩種巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基供選擇，其中之一無刃天青和瓊脂——引入思考：什么情況下應(yīng)選擇用？為什么我國(guó)只收載一種？,理由（5） 可能存

25、在嚴(yán)格厭氧菌——巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中所營(yíng)造的厭氧環(huán)境是否足以滿足嚴(yán)格厭氧菌的培養(yǎng)需要？ ——引入思考：現(xiàn)無菌檢查的實(shí)驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件是否足夠能滿足嚴(yán)格厭氧菌的檢出。,二、增加對(duì)檢出菌的檢定要求,理由（1） 面臨更高的要求。 隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展和國(guó)際交往的頻繁，人們對(duì)物質(zhì)文化生活及健康保障的要求越來越高，醫(yī)藥品的發(fā)展必將對(duì)藥品微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定、質(zhì)量監(jiān)督和檢測(cè)的任務(wù)提出更高的要求。,,理由（2）

26、 無菌檢查是高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品關(guān)乎用藥安全性的必檢項(xiàng)目，為對(duì)所檢供試品的質(zhì)量負(fù)責(zé)，對(duì)檢驗(yàn)質(zhì)量的負(fù)責(zé)，應(yīng)對(duì)檢出菌有一定的交代和證明。,,理由（3） 無菌檢查法前言中：“若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。” ——那么，若供試品不符合無菌檢查法的規(guī)定，是否就能表明絕對(duì)是供試品污染所致？ 怎么證明？確定是供試品污染所致？,理由（4） 全國(guó)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的建立

27、和發(fā)展，以及現(xiàn)有微生物檢定能力的證明，是藥典增加檢出菌檢定規(guī)定的基礎(chǔ)建設(shè)和技術(shù)支撐。,相信隨著科技的進(jìn)步、國(guó)家對(duì)藥品安全的關(guān)注，以及我們對(duì)無菌檢查法的深入研究和微生物檢定能力的發(fā)展，藥典無菌檢查法中增加對(duì)檢出菌的檢定要求是必須的，也是能夠做到的??！,,,,,,三、對(duì)每種接種后的培養(yǎng)基分別置兩種溫度下培養(yǎng) ——適合細(xì)菌生長(zhǎng)的溫度和適合真菌生長(zhǎng)的溫度， 使可能接種到某一培養(yǎng)基中去的菌都能得到適宜的生長(zhǎng)溫度，增加撿出率。,四、各論