酶動(dòng)力參數(shù)km、vmax和kcat值的計(jì)算

1、酶動(dòng)力參數(shù)酶動(dòng)力參數(shù)Km、Vmax和Kcat值的計(jì)算（以日立值的計(jì)算（以日立U3010為例）為例）強(qiáng)瑋強(qiáng)瑋2014331一、一、Km根據(jù)酶促反應(yīng)方程，即米曼式氏方程（MichaelisMentenequation）：V=(VmaxS)(KmS)當(dāng)v=0.5Vmax時(shí)，Km=[S]，可見(jiàn)Km等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率Vmax一半時(shí)的底物濃度。Km值一般在106~102molL之間，單位一般為mM或者uM。Km只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的

2、濃度無(wú)關(guān)。由于Km值與酶的濃度無(wú)關(guān)，所以計(jì)算時(shí)無(wú)需對(duì)蛋白進(jìn)行定量，理論上誘導(dǎo)破碎的菌體上清（粗酶液）即可用來(lái)測(cè)酶活計(jì)算。具體計(jì)算方法以前常用雙倒數(shù)法，但是這種算法現(xiàn)在稍微好一點(diǎn)的SCI雜志都不認(rèn)可了，相對(duì)來(lái)說(shuō)現(xiàn)在更準(zhǔn)確和更常用的計(jì)算方法是直接對(duì)不同濃度的底物測(cè)得的酶活數(shù)據(jù)用米氏方程（MichaelisMentenequationV=(VmaxS)(KmS)）進(jìn)行非線(xiàn)性回歸（nonlinearregression），擬合的方程中就給出了計(jì)

3、算出的Km值。非線(xiàn)性回歸方法相對(duì)于雙倒數(shù)法稍微麻煩的地方在于測(cè)量酶活時(shí)底物濃度的選擇要盡量多，并且要覆蓋米氏方程曲線(xiàn)的三個(gè)區(qū)域，以下圖為例，酶反應(yīng)速度遵循米氏方程的規(guī)律，先是一級(jí)反應(yīng)，速度隨底物濃度上升也直線(xiàn)上升，然后是混合級(jí)反應(yīng)，趨于平緩，最后進(jìn)入零級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速度不再隨濃度上升而上升，而是趨于一個(gè)穩(wěn)定的值。根據(jù)這個(gè)規(guī)律，具體梯度測(cè)試時(shí)，底物濃度的選點(diǎn)很重要，要根據(jù)實(shí)時(shí)測(cè)得的斜率或活度值實(shí)時(shí)調(diào)整，盡量要覆蓋這三個(gè)區(qū)域，這樣回歸擬合出來(lái)

4、的米氏方程才是準(zhǔn)確的，計(jì)算出的酶動(dòng)力參數(shù)才是正確的。020400.00.10.20.3初初初初初初初(mM)初初初HillFitof初初初用于非線(xiàn)性回歸分析的軟件很多，igin8.0我比較喜歡，將酶活數(shù)據(jù)輸入后，全選，“Analysis”菜單下選擇“Fitting”，進(jìn)一步選擇“Nonlinearcurvefit”進(jìn)入對(duì)話(huà)框，在函數(shù)歸類(lèi)框“Categy”中選址“GrowthSigmoidal”類(lèi)函數(shù)，接著在子函數(shù)框“Function”中

5、選擇“Hill”函數(shù)。由于igin8.0中沒(méi)有保存米氏函數(shù)，但是Hill函數(shù)與米氏函數(shù)類(lèi)似(如下)（“iginBasicFunctions”函數(shù)下的Hyperbl也是類(lèi)似與米氏函數(shù)的可選函數(shù)），當(dāng)n=1是就完全變成了米氏函數(shù)，所以接著在左邊的“Parameters”中將n=1的可選框構(gòu)上，點(diǎn)擊“Fit”進(jìn)行擬合，Km、Vmax值等擬合的數(shù)據(jù)就在彈出的窗口中顯示出來(lái)了，注意這里的Vmax值不是本文所指的Vmax值，兩者的意義和單位都不一樣

6、，發(fā)表用的Vmax單位通常為nkatmg1protein（見(jiàn)下文），而此處的Vmax為輸入數(shù)據(jù)時(shí)的Y軸值，如果數(shù)據(jù)由日立U3010分光光度計(jì)測(cè)得，則其代表“活度”，即每分鐘內(nèi)吸光度變化的量。XnHill函數(shù)：Y=VmaxKnXn三、三、KcatKcat是酶的催化常數(shù)，定義為在單位時(shí)間內(nèi)每一活性中心或每分子酶所能轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)，表示酶催化特定底物的能力。其單位一般是s1，即每秒鐘內(nèi)一個(gè)酶分子或酶活性中心能催化多少個(gè)底物發(fā)生反應(yīng)。還是以托

7、品酮還原酶TRI催化托品酮和NADPH的為例，其反應(yīng)方程式如下：托品酮NADPH→托品NADPNADP物的轉(zhuǎn)化量度關(guān)系上式0.10.1活度活度minmin=14.38=14.38nMminnMmin(NADPH)(NADPH)已經(jīng)提供了，我們只需對(duì)反應(yīng)中的蛋白定量就行了。還是以上面的例子計(jì)算，非線(xiàn)性回歸擬合出的Vmax=0.48879min(活度)，對(duì)應(yīng)的底物（NADPH）轉(zhuǎn)化量是△c(NADPH)=4.887914.38=70.29n

8、Mmin。每管反應(yīng)酶量為13.285ug重組酶蛋白的分子質(zhì)量為33245.88道爾頓（這里的重組酶分子質(zhì)量一定要加上前面融合的標(biāo)簽序列，這里是His標(biāo)簽），則酶分子數(shù)為1328533245.88=0.40nM每秒鐘每個(gè)酶分子催化的底物分子數(shù)即Kcat=70.29(0.4060)=2.93s1。注意：上面的計(jì)算默認(rèn)了每個(gè)酶分子都作為一個(gè)活性中心參與了催化反應(yīng)，而沒(méi)有顧及其是否以二聚體或多聚體的形式。事實(shí)上，有些酶是只以多聚體形式才有活性的

9、，這時(shí)就要準(zhǔn)確弄清楚是幾聚體，然后將相應(yīng)的Kcat值除以該值才是準(zhǔn)確的。四、四、KcatKmKcatKm用來(lái)衡量酶的催化效率。這一表示式又被稱(chēng)為特異性常數(shù)，其包含了催化反應(yīng)中所有步驟的反應(yīng)常數(shù)。由于特異性常數(shù)同時(shí)反映了酶對(duì)底物的親和力和催化能力，因此可以用于比較不同酶對(duì)于特定底物的催化效率或同一種酶對(duì)于不同底物的催化效率。其算法很簡(jiǎn)單，用Kcat值除以Km值即可，單位一般為s1M1或s1mM1，注意兩者是1000倍的關(guān)系，如上例，其Kc