基因突變和表觀遺傳變異

1、9 基因突變和表觀遺傳變異,表觀遺傳變異,9.1 基因突變的類型,3. 突變的性質(zhì)：稀有性（10-4~10-9）可逆性，突變的多方向性與復(fù)等位基因,體細(xì)胞突變與生殖細(xì)胞突變,2. 突變的類型：形態(tài)~，生化~，失去功能的~：無(wú)效~-滲漏~，獲得功能的~，致死~條件致死~,突變的多方向性 與復(fù)等位基因,中性突變（neutral mutation）多肽鏈中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生的氨基酸的取代并不影響蛋白質(zhì)的功能;沉默突

2、變（silent mutation）蛋白質(zhì)中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生了相同氨基酸的取代，即同義突變。,移碼突變（frameshift mutation）回復(fù)突變（reverse mutation）， 一類是正向突變（forward mutation）突變方向是從野生型向突變型；另一種是回復(fù)突變，其突變方向是從突變型向野生型抑制突變（suppressor mutation）突變的作用還可以通過(guò)其它位點(diǎn)的突變（A B）而得到補(bǔ)償或校正

3、。,9.2 基因突變的分子基礎(chǔ),9.2.1.自發(fā)突變的分子基礎(chǔ)突變率（mutation rate）指在單位時(shí)間內(nèi)某種突變發(fā)生的概率. 9.2.1.1 DNA復(fù)制錯(cuò)誤9.2.1.2 自發(fā)的化學(xué)變化 1. 脫嘌呤（depurination）作用 2. 脫氨（基）(deamination)作用 3. 氧化作用損傷堿基（oxidatively damaged bases） 4. 轉(zhuǎn)座子和插入序列引起的突變,,DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制,3’

4、 → 5’ 核酸外切酶活性——校對(duì)功能,DNA復(fù)制中的保真機(jī)制,堿基的互變異構(gòu)可造成復(fù)制差錯(cuò),堿基的互變異構(gòu)可造成復(fù)制差錯(cuò),DNA復(fù)制中堿基互變異構(gòu)引起的突變,DNA復(fù)制中堿基互變異構(gòu)引起的突變,DNA復(fù)制中堿基環(huán)出/跳格造成移碼突變,DNA復(fù)制中堿基環(huán)出/跳格造成缺失與重復(fù),9.2.1.2 自發(fā)的化學(xué)變化 1.脫嘌呤作用,2.脫氨基作用:C →U,,脫氨基作用: 5mC →T[突變熱點(diǎn)],3.氧化作用損傷堿基,過(guò)氧化物原子團(tuán)（O2

5、-）（H2O2），（-OH）等需氧代謝的副產(chǎn)物都是有活性的氧化劑， 它們可導(dǎo)致DNA的氧化損傷，T氧化后產(chǎn)生T－乙二醇，G氧化后產(chǎn)生8-氧-7,8二氫脫氧鳥嘌呤、8-氧鳥嘌呤(8-O-G)或“ GO”，GO可和A錯(cuò)配，導(dǎo)致G→T。,9.2.1.3 轉(zhuǎn)座子和插入序列引起的基因突變,9.2.1.4 不等交換產(chǎn)生重復(fù)和缺失突變,9.2.2 誘發(fā)突變的分子基礎(chǔ),9.2.2.1 放射線的誘發(fā)突變 紫外線、 X-射

6、線、 γ射線、 宇宙射線9.2.2.2 化學(xué)物質(zhì)的誘發(fā)突變 1.堿基類似物 (1) 5-溴尿嘧啶（5-bromouracil,5-BU） (2) 氨基嘌呤（2-aminopurine 2-AP） (3) 迭氮胸苷（AZT, azidothymidine）,2.堿基的修飾劑 (1) 亞硝酸（introus acid, NA） (2) 羥胺 (3) 烷化劑，它

7、們的作用是使堿基烷基化 3.DNA插入劑 原黃素（proflavin） 吖啶橙（acridine orange） 溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓 （etnidium bramide） ICR的復(fù)合物等,9.2.2.1 放射線誘發(fā)的突變,電離輻射（X-，?-射線）誘發(fā)染色體畸變和基因突變（堿基降解/脫氨……）射線波長(zhǎng)-能量-誘變效應(yīng)的關(guān)系UV 照射造成嘧啶二聚體

8、-切除-堿基隨機(jī)插入=突變,,,9.2.2.2 化學(xué)物質(zhì)誘變 1.堿基類似物,（1）5-溴尿嘧啶和T很相似，僅在第5個(gè)碳元子上由Br取代了甲基,5-BU有酮式、烯醇式兩種異構(gòu)體，可分別與A及G配對(duì)結(jié)合,堿基類似物（5-BU）的摻入——轉(zhuǎn)換,堿基類似物（2-AP）的摻入——轉(zhuǎn)換,堿基類似物（2-AP）的摻入——轉(zhuǎn)換,(2) 2-氨基嘌呤(2-AP)也是堿基的類似物，有正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)兩種異構(gòu)體，可分別與T和C配對(duì)結(jié)合。當(dāng)2-AP

9、摻入到 DNA復(fù)制中時(shí)，由于其異構(gòu)體的變換而導(dǎo)致A∶T G ∶ C,,2. 堿基的修飾劑 (1) 亞硝酸（introus acid, NA）有氧化脫氨作用，可使G第2個(gè)碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine,x），次黃嘌呤 (H) 仍和C配對(duì)，故不產(chǎn)生轉(zhuǎn)換突變。但C和A脫氨后分別產(chǎn)生U和次黃嘌呤H，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)換，使C∶G轉(zhuǎn)換成A∶T，A∶T轉(zhuǎn)換成G∶C,,亞硝酸（introus acid, NA）有氧化脫氨作

10、用，可使G →黃嘌呤（X）仍和C配對(duì)，故不產(chǎn)生突變；但C脫氨→ U，使C∶G轉(zhuǎn)換成A∶T； A脫氨→次黃嘌呤H，使A∶T轉(zhuǎn)換成G∶C。,堿基修飾劑的誘變作用,(1) 亞硝酸(2) 羥胺(3) MMS/EMS,,（2）羥胺只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個(gè)C原子上加-OH，產(chǎn)生4-OH-C，此產(chǎn) 物可以和A 配對(duì)，使C∶G轉(zhuǎn)換成T∶A,(3)烷化劑如甲基黃酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黃酸甲脂（MMS）,亞硝基胍（NG）

11、等，它們的作用是使堿基烷基化，EMS使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G和 O-4-E-T分別和T、G配對(duì)，導(dǎo)致G∶C對(duì)轉(zhuǎn)換成A∶T對(duì)；T∶A對(duì)轉(zhuǎn)換成C∶G,,烷化劑如甲基黃酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黃酸甲脂（MMS）,亞硝基胍（NG）等，使G → O-6-M-G=T配對(duì)，導(dǎo)致G∶C對(duì)轉(zhuǎn)換成A∶T；使T →O-4-M-T ≡ G配對(duì)，導(dǎo)致T∶A對(duì)轉(zhuǎn)換成C∶G；,3.DNA插入劑導(dǎo)致堿基增減,嵌合劑

12、的插入——移碼突變,9.3 體外定點(diǎn)誘變,1985年加拿大的Michael Smith建立，于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。具體方法有三種：（1）寡核苷酸介導(dǎo)的單鏈模板定點(diǎn)突變；（2）雙引物法定點(diǎn)突變；（3）用摻入U(xiǎn)的單鏈為模板進(jìn)行寡核苷 酸介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變。,寡核苷酸介導(dǎo)的單鏈模板定點(diǎn)突變,基于PCR 的體外定點(diǎn)突變,基于PCR 的體外定點(diǎn)突變,9.4 突變劑的檢測(cè),用 Ames法檢測(cè)誘變劑,突變和

13、人類疾病,（一）自發(fā)突變和人類的疾病一.重復(fù)序列異常所引起的遺傳病線粒體的腦脊髓?。╩itochondlrial encephalomyopathies)是線粒體重復(fù)順序之間產(chǎn)生缺失所致。脆性X染色體綜合征X-連鎖脊髓和延髓肌婁縮，也稱Kennedy’s癥強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良（Myotonic dystrophy）,,,(二) 誘發(fā)突變和人類的腫瘤,9.5 基因突變的生物學(xué)防護(hù)與修復(fù),9.5.1 DNA的防護(hù)機(jī)制1、密碼的簡(jiǎn)并性

14、、相似性 2、回復(fù)突變3、抑制突變（基因間抑制與基因內(nèi)抑制）4、 二倍體和多倍體5、致死與選擇,9.5.2 DNA的修復(fù)機(jī)制,一.直接修復(fù)（Direct repair）(一) 通過(guò)DNA聚合酶校正(3’ →5’外切)修復(fù)(二)光復(fù)活反應(yīng)光復(fù)活（photoreactivation）或光修復(fù)（light repair）光裂合酶（photolyase),由phr 基因編碼烷基轉(zhuǎn)移酶（Alkyltransferases）(如對(duì)

15、m6G),UV損傷的光修復(fù)/光復(fù)活,PR酶，光能UV→Py=Py特異低等生物的主要修復(fù)方式,(一) 一般切除修復(fù) 切除修復(fù)(excision-repair) 暗修復(fù)（dark repair） 切-補(bǔ)（-切）-封短-補(bǔ)丁修復(fù)（short-patch repair）（~20nt)組成型長(zhǎng)-補(bǔ)丁修復(fù)（long-patch repair） （1500nt)誘導(dǎo)型著色性干皮?。╔eroderma pigmentosum）是一

16、種切除修復(fù)酶的缺陷,二、切除修復(fù)（excision-repair）,,E.Coli 中的切除修復(fù)系統(tǒng),損傷：突變的堿基錯(cuò)配或改變DNA結(jié)構(gòu),剪切：內(nèi)切酶在損傷堿基位點(diǎn)兩側(cè)剪切,切除：外切酶除去切口間的DNA,合成：DNA pol 合成取代DNA,連接酶封閉缺口,,Uvr系統(tǒng)在修復(fù)各階段中的作用：UvrAB識(shí)別損傷， UvrBC在DNA上切一缺口， UvrD使被標(biāo)記區(qū)解旋,著色性干皮病（Xeroderma pigmentosum）

17、是一種切除修復(fù)酶的缺陷,(二) 特殊切除修復(fù)途徑,(1) AP核酸內(nèi)切酶修復(fù)途徑 AP位點(diǎn) :無(wú)嘌呤（apurinic）和 無(wú)嘧啶（apyrimidinic）位點(diǎn)(2) 糖基酶修復(fù)途徑,重組修復(fù)（recombination-repair）,在E.coli中的提取(retrival)系統(tǒng),9.6 基因突變的檢出,9.6.1 傳統(tǒng)遺傳學(xué)檢出法9.6.2 分子遺傳學(xué)檢出法,9

18、.6.1 傳統(tǒng)遺傳學(xué)檢出法,1、微生物突變的檢出抗性篩選——positive selection eg. +pen pen r 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選——negative selection eg. penicillin enrichment method 青霉素阻止細(xì)胞壁成分的合成，對(duì)擴(kuò)增細(xì)胞致死[MM+pen] (-/+) [CM] [MM]

19、 + -,,,,2、果蠅突變的檢出,（1）果蠅伴性隱性致死/非致死突變的檢出利用 Muller-5品系檢出X隱性突變（2）常染色體基因突變的檢出——平衡致死系的利用,（1）果蠅伴性隱性致死/非致死突變的檢出利用 Muller-5品系檢出X隱性突變,（2）常染色體基因突變的檢出——平衡致死系的利用,3、植物突變的檢出,L. Stadler 玉米子粒胚乳顏色突變

20、檢出CC×cc ↓ Cccc（無(wú)色）→存在突變擬南芥及其突變檢出 ？,9.6.2 分子遺傳學(xué)檢出法,9.6.2.1 單鏈構(gòu)像異構(gòu)多態(tài)性 （PCR-SSCP）,PCR-SSCPPCR-RFLP,9.6.2.2 用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)點(diǎn)突變,毛細(xì)管、強(qiáng)電場(chǎng)（離子表面積、外形差異）、高散熱、高通量,9.6.2.3 等位基因特異寡核苷酸雜交,利用堿基對(duì)差異-雜交強(qiáng)度差異檢測(cè),9.6.2.4 序列分

21、析與DNA芯片檢測(cè),,Sequencing Sequencing is the procedure of choice for SNP discovery. The most common forms of sequencing are based on primer extension using either a) dye-primers and unlabeled terminators or b) unlabeled prim

22、ers and dye-terminators. The products of the reaction are then separated using electrophoresis using either capillary electrophoresis or slab gels.,DNA序列分析（1）,Sanger 雙脫氧鏈末端終止法/酶促DNA序列測(cè)定法,Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法堿基特異修飾-特異斷裂,D

23、NA序列分析（2）,DNA芯片/微陣列技術(shù),+Enzyme+ddATP+dCTP/dGTP/dTTP,MassArray （2）,Figure II. Same DNA, different people: monozygotic twins share the same genome, but a different epigenome. The distinct pattern of DNA methylation and hi

24、stone modifications can explain different phenotypes and individual susceptibility to disease. Proc Natl Acad Sci USA 102, 10604-10609, 2005.,9.7 表觀遺傳變異,在DNA序列未改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳變化稱表觀遺傳修飾（ epigenetic modification）或表觀遺傳變異（e

25、pigenetic variation）.表觀遺傳修飾/表觀遺傳變異 多源于DNA甲基化和組蛋白的甲基化/乙?；刃揎?。如，X 染色體失活，基因組印記等等。,轉(zhuǎn)基因沉默 ？,由DNA甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默,轉(zhuǎn)錄的基因沉默（TGS）——啟動(dòng)子甲基化轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）——編碼區(qū)甲基化,轉(zhuǎn)錄后基因沉默的其它機(jī)理 （RNAi?）,According to the principle of genetic information