硫丹對生物DNA損傷和土壤微生物群落多樣性的影響.pdf

1、持久性有機污染物(簡稱POPs)，被認為是21世紀影響人類生存與健康的重要環(huán)境問題。由于持久性有機污染物在全球普遍存在，具有生物累積性、難以降解、可遠距離傳輸、致癌致突變性和內(nèi)分泌干擾等特性，它們所引起的環(huán)境與健康問題已經(jīng)引起國際環(huán)境保護組織、各國政府和民眾的高度關(guān)注。硫丹為有機氯殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，殺蟲譜廣，廣泛用于棉花、果樹、蔬菜、茶葉等作物上，我國已大面積使用。20世紀90年代以后，越來越多的國家認識到了硫丹廣泛使用的危害

2、性，許多國家開始禁用或嚴格限制使用。作為一種即將被列入POPs名單的污染物，硫丹對人體健康和生態(tài)環(huán)境的潛在影響問題在國內(nèi)外備受關(guān)注，研究其生態(tài)毒性非常重要。鑒于土壤微生物、動物、植物在生態(tài)系統(tǒng)中的重要性，本研究利用分子生物學技術(shù)，采用微核實驗、彗星試驗和變性梯度凝膠電泳實驗，研究了硫丹對蠶豆、白三葉草、蚯蚓和土壤微生物的毒性效應，評價了硫丹對生物DNA的損傷作用和土壤微生物群落多樣性的影響，對于了解和認識硫丹對生態(tài)系統(tǒng)的影響以及為建立快

3、速、有效、實用的生物監(jiān)控和測試技術(shù)具有重要意義。主要研究結(jié)果如下： 1.為了探明硫丹對蠶豆的遺傳損傷作用，采用毒理學實驗方法，研究了0.1、1.0、10.0 mg/L，濃度的硫丹對蠶豆根尖細胞有絲分裂、染色體畸變和微核的影響。研究結(jié)果表明，硫丹抑制蠶豆根尖細胞的有絲分裂。經(jīng)硫丹處理后，蠶豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)則逐漸降低，降低的程度隨硫丹的濃度和染毒時間的增加而增強。隨著硫丹的濃度和染毒時間的增加，蠶豆根尖細胞的染色體畸變率和微核

4、率不斷提高。有絲分裂指數(shù)與染色體畸變和微核率都呈負相關(guān)，染色體畸變率與微核率呈正相關(guān)，并具有明顯的劑量-效應關(guān)系。在本試驗條件下硫丹達到一定劑量濃度會對蠶豆根尖細胞造成DNA損傷，具有明顯的遺傳毒性。 2.單細胞凝膠電泳實驗(彗星試驗)是一種快速、簡單、直接的DNA損傷研究手段，能廣泛應用于多種組織來快速檢測環(huán)境基因毒性物質(zhì)。本文通過彗星試驗測定了硫丹對蚯蚓體腔細胞和白三葉草葉片細胞DNA的損傷作用。試驗結(jié)果顯示，在設(shè)定的四個檢

5、測時間(7d、14d、21d、28d)，經(jīng)不同濃度硫丹處理，蚯蚓體腔細胞和白三葉草葉片細胞DNA均有損傷，而且隨著濃度的增加和時間的延長，彗星拖尾長度、Olive尾矩的值均有上升的趨勢，這說明DNA損傷程度與硫丹的濃度和處理時間均有效應關(guān)系。表明硫丹對蚯蚓和白三葉草造成了基因損傷。 本研究首次利用廣泛分布的白三葉草作為受試生物材料，進行污染物的彗星試驗檢測試驗。通過實驗發(fā)現(xiàn)，和對照處理相比，經(jīng)過硫丹處理后白三葉草葉片細胞能夠通過

6、彗星試驗檢測DNA損傷，而且隨硫丹處理濃度的增加和暴露染毒時間的延長，細胞核產(chǎn)生的傷害程度也隨之增加，具有較高的靈敏性。表明白三葉草葉片能應用于植物彗星實驗，研究環(huán)境污染對植物DNA的損傷。 3.采用三種不同方法，分別對土壤微生物總DNA進行提取效果的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運用化學試劑和酶結(jié)合的策略能夠獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的基因組DNA，較其他方法具有明顯的優(yōu)勢和效果，并且獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后更適用于隨后的分子生物學實驗。 4.采用

7、擴增細菌16Sr DNA V3區(qū)的通用引物，通過改變擴增反應體系中的Mg2+、dNTP、引物的條件，并采用Nest-PCR方法，優(yōu)化了含有“GC”結(jié)構(gòu)引物的PCR擴增方法，獲得了較好的擴增產(chǎn)物，使得DGGE電泳圖譜條帶更清晰，可分辨的條帶數(shù)量也更多。 5.利用DGGE指紋分析技術(shù)研究了硫丹對土壤微生物群落多樣性的影響。通過對不同培養(yǎng)時間(7d、14d、21d、28d)、不同濃度(0.1、1.0、10.0 mg/kg)硫丹污染下土

8、壤微生物DNA進行DGGE多樣性的分子指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間不同，各處理之間的土壤微生物群落多樣性出現(xiàn)了一定的差異。在硫丹作用下，土樣中一些細菌種群的生長受到抑制，隨著硫丹或作用時間的提高或延長，其相關(guān)條帶由深變淺，甚至消失。而另一些細菌種群的得到富集，其條帶由無到有。在整個試驗過程中，隨著硫丹濃度的升高，與對照相比各泳道條帶間的Jaccard指數(shù)相似性相應降低，在一定濃度和作用時間范圍內(nèi)，硫丹對土壤細菌種群的改變的影響存在劑量