北京地區(qū)重金屬污染土壤元基因組文庫的構(gòu)建及重金屬抗性微生物的篩選.pdf

1、土壤重金屬污染已成為全球關(guān)注的環(huán)境問題之一。重金屬污染不僅使農(nóng)田土壤肥力退化，農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)降低，而且促使水環(huán)境惡化，并且通過食物鏈最終危及人類的生命健康。北京東南郊污灌區(qū)是全國五大污灌區(qū)之一，據(jù)報道部分地區(qū)存在土壤重金屬超標(biāo)問題。在重金屬污染土壤的治理方法中，最有前景的是生物修復(fù)技術(shù)，微生物的重金屬抗性基因在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中起著重要的作用。近年來發(fā)展起來的元基因組技術(shù)可以直接研究環(huán)境樣品中的微生物基因組，避開了未能培養(yǎng)微

2、生物的純培養(yǎng)技術(shù)難題，開辟了利用微生物基因資源的新途徑。 本研究旨在探索出一套高效的從土壤樣品中提取、純化大片段DNA的方法，然后構(gòu)建北京重金屬污染土壤的元基因組文庫，從中篩選重金屬汞、鎘的抗性基因；同時采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離重金屬抗性細(xì)菌，為重金屬抗性基因的分離、鑒定提供另一途徑。 本研究探索出了一套高效的重金屬污染土壤混合基因組的提取、純化方法。此方法操作簡便，純化后DNA得率為40～50μg DNA/g土，并達(dá)到了

3、進(jìn)行分子水平操作的純度。以質(zhì)粒pBluescript SK(+)為載體，構(gòu)建重金屬污染土壤的元基因組文庫，文庫包含10080個轉(zhuǎn)化子，平均外源片段大小為4.5kb左右，庫容量為45Mb左右，文庫中54.2﹪的單克隆插入片段大于3kb；約50﹪的插入片段大小在2～4kb之間；小于2kb的插入片段只占總克隆數(shù)量的8.3﹪。經(jīng)隨機(jī)檢測，所構(gòu)建文庫包含的插入片段隨機(jī)性很高。進(jìn)一步用功能驅(qū)動的篩選方法進(jìn)行了重金屬抗性基因篩選，獲得了一個具有鎘抗性

4、的陽性克隆，其Cd<'2+>的耐受能力達(dá)到了150ug/mL。提取該陽性克隆質(zhì)粒，做初步酶切分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化子包含外源片段大小為2.47kb。對其進(jìn)行序列測定與分析，通過BlastX檢索，沒有發(fā)現(xiàn)與其有明顯相似性的序列。這一序列的來源和功能鑒定還有待于進(jìn)一步的研究。 通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，從重金屬污染土壤中分離出4株重金屬汞抗性菌株，它們對Hg<'2+>的耐受能力達(dá)到22.2μg/mL。通過16S rDNA的序列分析，確定這4