09年醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)考博試題

1、一、名詞解釋：1.SNP: 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的 DNA 序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。占所有已知多態(tài)性的 90%以上。SNP 在人類基因組中廣泛存在，平均每 500～1000 個(gè)堿基對(duì)中就有 1 個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá) 300 萬(wàn)個(gè)甚至更多。 ； 2.mRNA 的選擇性剪切； 的選擇性剪切；前體 m

2、RNA 的剪接是基因表達(dá)調(diào)控中的重要環(huán)節(jié)，也是生物功能多樣性的分子機(jī)制之一. 目前已知它包括兩種互相關(guān)聯(lián)的機(jī)制: 組成性剪接和選擇性剪接(或稱調(diào)節(jié)性剪接)。在組成性剪接中，剪接位點(diǎn)不因細(xì)胞種類發(fā)育階段或環(huán)境而改變，因而最終形成的基因表達(dá)產(chǎn)物也是不變的。而選擇性剪接則不同，作為基因多樣性的分子機(jī)理，它選擇性地對(duì)內(nèi)含子或外顯子進(jìn)行剪接，從而將同一種前體 mRNA 剪接成多種不同的成熟 mRNA，進(jìn)而表達(dá)多個(gè)可能具有不同生理學(xué)功能的蛋白質(zhì)，

3、最終影響生理功能的調(diào)節(jié).3.抑癌基因； 抑癌基因；編碼對(duì)腫瘤形成起阻抑作用的蛋白質(zhì)的基因。正常情況下負(fù)責(zé)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。當(dāng)這些基因不能表達(dá)，或者當(dāng)其產(chǎn)物失去活性時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞癌變。如 p53 基因和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(Rb 基因)。4.基因芯片； 基因芯片；固定有寡核苷酸、基因組 DNA 或互補(bǔ) DNA 等的生物芯片。利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對(duì)樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。二、簡(jiǎn)答題：1.限制性內(nèi)切

4、酶及影響因素； 限制性內(nèi)切酶及影響因素；生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈 DNA 序列的一種內(nèi)切核酸酶。它可以將外來(lái)的 DNA 切斷，即能夠限制異源 DNA 的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的 DNA 卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在 DNA 分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱限制酶)。2.熒光定量 熒光定量 PCR 及影響因素； 及影響因素；熒光定量 PCR 是一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒

5、光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。引物的設(shè)計(jì)和選擇符合熒光 PCR 的探針并進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)時(shí)熒光 PCR 尤其重要。1.靶基因的確定：選擇檢測(cè)組共有的基因以避免檢測(cè)的假陰性(漏檢)。2.檢測(cè)片段的確定：選擇檢測(cè)組內(nèi)的保守 (突變少)（避免假陰性） 、組間特異的序列 (突變多)（避免假陽(yáng)性）作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長(zhǎng)度 70-150bp

6、。3.引物：長(zhǎng)度 17-25bp;GC 含量 30-80%;退火溫度(Tm 值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測(cè)）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的 G，3’端避免 G 或 C，最后 5 個(gè)堿基內(nèi)避免兩個(gè)以上的 G 或 C。4.探針：長(zhǎng)度 20-30bp（Taqman)或 16-25bp(MGB)；GC 含量 30-80%；Tm 值為 68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (自由能大于-3

7、.5kc/m)；5’端不能是 G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長(zhǎng)差異較大（多聯(lián)檢測(cè)）或 Fam(單聯(lián)檢測(cè)）的熒光標(biāo)記。5.其他:引物退火溫度, 引物濃度; 引物、探針的純度和穩(wěn)定性;熱啟動(dòng);鎂離子濃度;模板質(zhì)量;模板濃度;防止殘余(Carry-over)污染3.癌基因活化的分子機(jī)制； 癌基因活化的分子機(jī)制；（一）獲得啟動(dòng)子與增強(qiáng)子。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(含強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)插入原癌基因附近或內(nèi)部時(shí)，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致癌變。

8、 （二）基因易位—染色體易位重排，導(dǎo)致原來(lái)無(wú)活性的原癌基因移至強(qiáng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子附近而活化。 （三）原癌基因擴(kuò)抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時(shí)避免對(duì)正常組織的毒副作用。同時(shí)將抑制序列選擇在特定的位點(diǎn)，可對(duì)部分有明確基因突變的惡性腫瘤細(xì)胞如含有 BCL/ABL 或 AML1/MTG8 融合基因的白血病細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用。此外尚可通過(guò)使用腫瘤特異性啟動(dòng)子如 hTERT 啟動(dòng)子、survivin 啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子如酪氨酸酶啟動(dòng)子、骨鈣素

9、啟動(dòng)子引導(dǎo)針對(duì)某些癌基因或抗凋亡分子的 siRNA 或 shRNA 表達(dá)，從而達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。 RNAi 在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景:已證實(shí) N-Ras 或 BRAF 的激活型突變是引發(fā)黑素瘤的主要病因，其中 66%的病例為 BRAF 激酶作用域突變。而約 80%的 BRAF 突變病例是因胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰试斐傻?599 位的纈氨酸突變?yōu)楣劝彼崴?。使?RNAi 技術(shù)剔除黑素瘤細(xì)胞的 BRAF 表達(dá)，不僅抑制了腫瘤細(xì)胞生

10、長(zhǎng)，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。 最近研究表明趨化因子受體 CXCR4 是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因素，其配體 CXCL12 可趨化腫瘤細(xì)胞并調(diào)節(jié)其增生和侵襲特性。使用 RNAi 干擾技術(shù)剔除 CXCR4證實(shí)該分子為原位移植腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需。此外，剔除 BCRP 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)其介導(dǎo)的腫瘤耐藥。 瘢痕疙瘩是一種較為難治的疾病，目前尚無(wú)有確切療效的治療方法。使用特異性 siRNA 剔除 TGF-βII 型受體表達(dá)可以抑

11、制角膜成纖維細(xì)胞表達(dá)纖維粘連蛋白并降低其遷移能力。剔除 CTGF 表達(dá)可使皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi) I 型和 III 型前膠原蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織金屬蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2 和 TIMP-3 等基因表達(dá)水平降低。這些結(jié)果提示 TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和 CTGF 均可能是瘢痕疙瘩治療的潛在靶點(diǎn)。 病毒性疾病的治療:加州大學(xué)洛杉磯分校和

12、加州理工學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)出使用 RNAi 技術(shù)來(lái)阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。這個(gè)研究小組設(shè)計(jì)合成的 lenti 病毒載體引入 siRNA，激發(fā) RNAi 使其抑制了 HIV-1 的 coreceptor-CCR5 進(jìn)入人體外周 T 淋巴細(xì)胞，而不影響另一種 HIV-1 主要的 coreceptor-CCR4，從而使以 lenti 病毒載體為媒介引導(dǎo) siRNA 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療 HIV-1 和其他病毒感染性疾病的可行

13、性大大增加。RNAi 還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA 已證實(shí)介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用 siRNA 對(duì) Magi 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對(duì)病毒的抵抗能力增強(qiáng)。在最近全世界約 30個(gè)國(guó)家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS）的防治研究中，RNAi 也受到了重視。siRNA 在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基

14、因和相關(guān)宿主基因的 siRNA 所阻斷，這些結(jié)果提示 RNAi 能勝任許多病毒的基因治療，RNAi 將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對(duì)于許多嚴(yán)重的動(dòng)物傳染病的防治具有十分重大的意義。 遺傳性疾病的治療美國(guó)西北大學(xué)的 Carthew R W 和日本基因研究所的 Ishizuka A 等人發(fā)現(xiàn) RNAi 同脆性X 染色體綜合征（與 FMR-1 基因異常有關(guān)的導(dǎo)致智力低下的染色體病）之間的關(guān)系密切，揭示了與 RNAi 相關(guān)機(jī)制的缺陷可能導(dǎo)致

15、人類疾病的病理機(jī)制。遺傳性疾病的 RNAi 治療成為當(dāng)今研究 RNAi 的又一大熱點(diǎn)。 腫瘤病的治療腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而 RNAi 可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的 dsRNA 分子，只注射一種dsRNA 即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種 dsRNA 而將多個(gè)序列不相關(guān)的基