小立碗蘚羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶基因功能及調(diào)控研究初探.pdf

1、在陸生植物的演化過程中，苯丙烷類化合物扮演著重要作用。小立碗蘚在進化過程中處于植物從水生向陸生生境進化的過渡階段，研究小立碗蘚的苯丙烷代謝途徑可使我們進一步了解苯丙烷類化合物的進化歷程。本實驗室此前構(gòu)建了匯集苔蘚植物，單子葉植物與雙子葉植物中研究較多的幾種模式植物BAHD家族基因的進化樹。在其中的一個進化支中，數(shù)種植物的苯丙烷代謝途徑中的HCT功能已經(jīng)鑒定，但小立碗蘚的HCT功能并未報道。本研究以此為基礎(chǔ)，利用原核表達、超量表達、酵母單

2、雜、及煙草熒光素酶檢測系統(tǒng)來研究小立碗蘚PpHCT的功能，為研究小立碗蘚苯丙烷代謝途徑提供依據(jù)。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過PCR獲得PpHCT基因傘長cDNA序列和部分截短的cDNA序列，并克隆到原核表達載體pJAM1786上，分別命名為pJC2和pJC1196。將它們轉(zhuǎn)入菌株BL21中表達，PpHCT獲得可溶性蛋白上清液。利用可溶性蛋白上清液檢測了PpHCT的底物特異性。HPLC-MS結(jié)果顯示當(dāng)以p-cou

3、maroyl CoA為?；w時，PpHCT催化反應(yīng)的?；荏w為quinate和shikimate;當(dāng)以caffeoyl CoA，feruloyl CoA為?；w時，PpHCT催化反應(yīng)的?；荏w只能是shikimate; PpHCT催化反應(yīng)不能以sinapoyl CoA為?；w。PpHCT的底物親和力高低為coumaroyl quinate＞coumaroyl shikimate＞ caffeoyl shikimate＞ ferul

4、oyl shikimate。此結(jié)果說明PpHCT具有?；D(zhuǎn)移酶功能，但底物廣譜性與其他物種有所區(qū)別。這種區(qū)別可能是PpHCT比其他物種HCT多出一段氨基酸序列所致。
　　 2.通過gateway克隆將PpHCT全長cDNA序列和部分截短的cDNA序列構(gòu)建到超表達載體PH2GW7（含Ubiquitin啟動子）和pB7WG2.0上，分別命名為pJC554、pJC557、pJC555和pJC556。通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pJ

5、C554轉(zhuǎn)化到小立碗蘚原生質(zhì)體中，獲得抗性小立碗蘚植株;通過擬南芥的蘸花法將pJC555和pJC556轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型中，分別得到7和5株T1代陽性植株;利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pJC554和pJC557轉(zhuǎn)化到水稻ZH11愈傷，分別得到30和10株T0代陽性植株。
　　 3.通過RT-PCR方法檢測了pJC554，pJC557轉(zhuǎn)化得到的陽性植株分蘗期PpHCT和OsHCT的表達量和pJC555，pJC556轉(zhuǎn)化陽性植株抽苔期Pp

6、HCT和AtHCT的表達量。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性植株中PpHCT基因都得到了超量表達;同時，OsHCT與AtHCT在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株中沒明顯變化。利用HPLC-MS檢測了異源超表達了小立碗蘚PpHCT在抽苔期擬南芥與分蘗期水稻中的PpHCT酶反應(yīng)產(chǎn)物，氨基酸與部分黃酮類物質(zhì)的變化。結(jié)果顯示，在PpHCT陽性轉(zhuǎn)化植株中部分酶反應(yīng)產(chǎn)物得到提高，而這種變化在PpHCT-deletion中不存在，說明PpHCT序列的完整性對其功能發(fā)揮是必須的。<

7、br>　　 4.通過將小立碗蘚基因組中預(yù)測的R2R3型MYB與擬南芥和水稻中已報道的調(diào)控木質(zhì)素的MYB進行序列比對，篩選出可能調(diào)控PpHCT的MYB基因。通過PCR獲得這些基因的全長CDNA序列，并克隆到帶35S啟動子的載體pB7WG2.0上。同時通過PCR獲得PpHCT上游1.9 kb的啟動子片段和AtHCT上游1.5 kb的啟動子片段克隆到帶熒光素酶報告基因的載體pGW::Luciferase上。通過熒光素酶檢測檢測系統(tǒng)檢測MYB