基于信號(hào)放大技術(shù)在腫瘤細(xì)胞及其標(biāo)志物中的研究.pdf

1、本文采用表面增強(qiáng)拉曼散射分析方法和熒光分析方法，設(shè)計(jì)納米金生物條碼用于SERS活性檢測(cè)，構(gòu)建了基于靶循環(huán)放大方法和聚合剪切引發(fā)的循環(huán)放大方法、基于三螺旋分子探針和滾環(huán)復(fù)制的循環(huán)放大方法、基于靶引發(fā)的發(fā)卡DNA循環(huán)放大方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶菌酶、miRNA等腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、高特異性檢測(cè)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、爬煤唵畏椒ㄖ苽淞艘环N新型的DNA四螺旋結(jié)構(gòu)分子(FHJM)探針，它包含三個(gè)功能部分:適體-目標(biāo)物識(shí)別區(qū)域，引發(fā)循環(huán)放大反

2、應(yīng)的觸發(fā)區(qū)域，聚合-剪切放大反應(yīng)的模板區(qū)域。四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針中的引發(fā)鏈DNA-1被設(shè)計(jì)成含有溶菌酶適配子的一段序列，用于靶的識(shí)別，并構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針左側(cè)兩邊手臂中的一支。用于聚合剪切的模板鏈DNA-2通過瓦特生-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針中的右邊部分。它右側(cè)的兩個(gè)分支通過單鏈DNA-b連接從而構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針右側(cè)的環(huán)形部分，基于交叉堿基配對(duì)原理，觸發(fā)鏈DNA-b構(gòu)成了我們分支探針的四螺旋序列。當(dāng)存在溶菌

3、酶時(shí)，它可以與DNA-6鏈雜交。我們首次將這種探針引入到表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測(cè)技術(shù)中,成功發(fā)展了一種FHJM-SERS檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶菌酶的高靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)限可以低至0.5fM。結(jié)合了適體識(shí)別技術(shù)，F(xiàn)HJM-SERS的檢測(cè)方法具有很好的特異性，如果把各種識(shí)別單元植入到這種FHJM探針中，將可能構(gòu)建一種能夠識(shí)別各種目標(biāo)物的傳感平臺(tái)。另外，該方法為我們提供了一個(gè)高靈敏性的平臺(tái)，這極大的拓展了我們的研究視野。
　　⑵基于

4、核酸分子聚集體(NAMAs)在氧化石墨烯納米片(graphene oxide，簡稱GO)上自組裝和由靶識(shí)別區(qū)域及引發(fā)滾環(huán)放大反應(yīng)的引物區(qū)域構(gòu)成的三螺旋結(jié)構(gòu)，我們研發(fā)了一種新型的，高靈敏的方法來檢測(cè)miRNA和進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)成像分析，這是首次將滾環(huán)放大反應(yīng)引入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。修飾有FAM熒光基團(tuán)的單鏈DNA能夠被氧化石墨烯納米片猝滅，但當(dāng)遠(yuǎn)離時(shí)，又會(huì)重新恢復(fù)熒光。值得注意的是，核酸分子自組裝策略被成功的應(yīng)用于低豐度靶miRNA的檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)成像分

5、析。與傳統(tǒng)的滾環(huán)放大反應(yīng)比較，自組裝的核酸分子聚集體能在細(xì)胞內(nèi)聚集并在單個(gè)的癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生明亮的熒光斑點(diǎn)，因此可以顯著的區(qū)別癌細(xì)胞和正常細(xì)胞?；诤怂岱肿泳奂w的細(xì)胞內(nèi)靶miRNA成像技術(shù)對(duì)早期癌癥檢測(cè)起到了極大的促進(jìn)作用，成為一種新型有效的可視化細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。
　?、峭ㄟ^對(duì)介孔二氧化硅納米粒子的氨基化修飾(PCMSNs)，使其表面呈正電，利用正負(fù)電相互吸引，使得核酸分子聚集體在其表面發(fā)生自組裝之后進(jìn)入細(xì)胞，在此原理的基礎(chǔ)上，首次設(shè)

6、計(jì)了基于氨基修飾的介孔二氧化硅納米粒子核酸分子聚集體(ONAAs)自組裝，引發(fā)單細(xì)胞內(nèi)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶microRNA的檢測(cè)。由此，我們構(gòu)建了一種新型的ONAAs-PCMSNs策略用于單細(xì)胞內(nèi)靶miRNAs的分析。整個(gè)策略的設(shè)計(jì)關(guān)鍵是核酸分子通過靜電作用發(fā)生自組裝，能夠引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的聚集與放大。我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針DNA-N1和DNA-N2，其中DNA-N2分別修飾熒光分子ROX和猝滅分子B

7、HQ。發(fā)卡探針DNA-N1和DNA-N2的環(huán)部區(qū)域可以靈活的在表面帶有正電荷的PCMSNs上發(fā)生自組裝；當(dāng)探針N1和N2在PCMSNs表面自組裝后，導(dǎo)入活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行孵育，在靶的誘導(dǎo)作用下使其表面的N1發(fā)生游離或者流動(dòng)性增加。然后，大量的發(fā)卡N2鏈的莖部被打開。在該方法中，鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過N1和N2的交替雜交而引發(fā)，形成N1和N2的聚集體。由于靜電吸引作用，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物在PCMSNs表面發(fā)生自組裝，形成具有穩(wěn)定的構(gòu)象的核酸分子聚集體，進(jìn)而