亞洲玉米螟Ⅳ家族幾丁質酶的克隆表達、性質表征及抑制劑研究.pdf

1、幾丁質參與組成昆蟲的外骨骼及圍食膜等結構，其合成及降解過程的動態(tài)調控對昆蟲的生長發(fā)育至關重要。幾丁質酶(EC3.2.1.14)是昆蟲幾丁質降解過程的關鍵酶之一，負責將幾丁質多糖降解為幾丁二糖及幾丁三糖。昆蟲幾丁質酶是由一個龐大的基因家族編碼的，該酶分為八個家族，其中Ⅳ家族幾丁質酶主要分布于中腸組織，對昆蟲圍食膜的合成及降解、含幾丁質食物的消化以及對外來病原體的免疫等方面發(fā)揮重要功能，可能作為綠色殺蟲劑的潛在靶標。因此，針對昆蟲Ⅳ家族幾丁

2、質酶的酶學性質及抑制劑的研究，有助于了解其結構-功能關系，并為綠色農藥的設計提供指導。
　　本研究主要內容包括：⑴通過PCR擴增及RACE等手段，得到了亞洲玉米螟來源的Ⅳ家族幾丁質酶OfChtⅣ的cDNA序列。該cDNA序列全長為1380 bp，編碼區(qū)長度為1218 bp，能夠編碼405個氨基酸，N-末端是長度為18個氨基酸的信號肽，推測其為分泌蛋白。系統(tǒng)分析顯示OfChtⅣ與歐洲玉米螟Ⅳ家族幾丁質酶OnChtⅣ親緣關系最近。⑵構

3、建了OfChtⅣ的表達載體，并電轉入畢赤酵母GS115細胞中。采用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導表達120 h時，發(fā)酵液上清的相對活力達到最大。將硫酸銨沉淀、凝膠過濾和金屬螯合層析聯(lián)合使用，實現(xiàn)了重組ofChtⅣ的分離純化。⑶對重組OfⅣ進行生化性質表征。采用糖肽酶F處理OfChtⅣ，分析其具有N-糖基化現(xiàn)象。OfChtⅣ對pNP-β-(GlcNAc)2和膠體幾丁質的最適pH均為酸性pH4.0;對膠體幾丁質的Km值為13.11 mg·mL

4、-1，對pNP-β-(GlcNAc)2的Km值為0.21 mM。⑷萘酰亞胺類化合物和殼聚糖對OfChtⅣ均具有一定的抑制活性。隨著聚合程度的增大，殼聚糖對OfChtⅣ的抑制活性也有所增強，其中殼五糖、殼六糖、殼七糖的IC50值分別為333.5μM、60.1μM和12.4μM。⑸20家族β-N-乙酰己糖胺酶是昆蟲幾丁質降解系統(tǒng)中的另一種關鍵酶。針對亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1，采用晶體結構解析和分子對接等手段，對經典抑制劑N