活性氧和兼性共生菌在豌豆蚜免疫系統(tǒng)中的作用研究.pdf

1、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum是第一個(gè)完成基因組測序的半翅目昆蟲，且含有一種專性共生菌布赫氏體Buchnera aphidicola和多種兼性共生菌，因此是研究蚜蟲和微生物相互作用的很好的模式昆蟲。截止目前，對(duì)于豌豆蚜的免疫的研究仍十分有限。
　　活性氧(reactive oxygen species，ROS)能夠被有機(jī)體通過氧化迸發(fā)的形式迅速產(chǎn)生來抵御病原物的感染，之前的研究暗示活性氧可能在豌豆蚜免疫中起作用，而兼

2、性共生菌能夠保護(hù)蚜蟲抵御寄生蜂和病原真菌的寄生和侵染。本研究中，我們測定了細(xì)菌感染以后豌豆蚜體內(nèi)的活性氧水平以及活性氧相關(guān)基因的表達(dá)，克隆及表達(dá)了豌豆蚜過氧化物氧化還原酶1和2(A.pisum Peroxiredoxin1，2，ApPrx1，ApPrx2)并分析了其在豌豆蚜免疫中的作用;鑒定了實(shí)驗(yàn)室豌豆蚜品系兼性共生菌的類型，通過存活率的比較探明了兼性共生菌對(duì)豌豆蚜免疫的影響，并測定了病原菌感染后豌豆蚜共生菌種群密度的變化。主要結(jié)果如下

3、:
　　革蘭氏陰性菌綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和革蘭氏陽性菌藤黃微球菌Micrococcus luteus感染均能造成豌豆蚜顯著死亡，而綠膿桿菌感染后豌豆蚜的死亡率更加顯著。綠膿桿菌和藤黃微球菌的感染均能誘導(dǎo)蚜蟲體內(nèi)活性氧水平升高，相比之下，藤黃微球菌感染后24小數(shù)內(nèi)蚜蟲體內(nèi)活性氧水平升高的更加劇烈。包括催化活性氧產(chǎn)生的雙氧化酶(dual oxidase，DUOX)和超氧化物歧化酶(superoxide

4、dismutase，SOD)以及活性氧解毒酶過氧化物氧化還原酶在內(nèi)的多個(gè)基因在細(xì)菌感染后均有不同程度的差異表達(dá)，上調(diào)和下調(diào)因感染后時(shí)間的不同而不同。
　　重組ApPrx1和ApPrx2蛋白均具有抗氧化活性，能夠有效清除過氧化氫，保護(hù)DNA免受氧化損傷。當(dāng)蚜蟲被細(xì)菌感染或注射過氧化氫時(shí)，ApPrx1和ApPrx2的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。通過顯微注射dsRNA對(duì)ApPrx1和ApPrx2進(jìn)行RNA干擾，結(jié)果顯示，ApPrx1和ApPrx2的表

5、達(dá)均在注射后第三天顯著降低，對(duì)ApPrx1和ApPrx2的干擾效率分別約為35％和50％。通過RNA干擾降低ApPrx1表達(dá)之后，藤黃微球菌感染的蚜蟲的存活率顯著降低，注射dsApPrx1的蚜蟲被細(xì)菌感染后其體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)在48 h顯著低于對(duì)照，而其體內(nèi)的過氧化氫水平則顯著高于對(duì)照。干擾ApPrx2表達(dá)后，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染的蚜蟲的存活率顯著降低，綠膿桿菌感染的蚜蟲的存活率無顯著變化，金黃色葡萄球

6、菌感染的蚜蟲體內(nèi)的過氧化氫水平更高而細(xì)菌數(shù)目較低，綠膿桿菌感染后細(xì)菌數(shù)目無顯著變化，表明干擾ApPrx1和ApPrx2后蚜蟲存活率的降低是由于氧化脅迫升高導(dǎo)致的。
　　通過PCR檢測實(shí)驗(yàn)室豌豆蚜品系中的兼性共生菌類型，檢測到只含有Serratiasymbiotica這一種兼性共生菌。顯微注射氨芐青霉素清除S.symbiotica建立了穩(wěn)定的無兼性共生菌豌豆蚜品系。利用三種革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、肺炎鏈球菌Stre

7、ptococcus pneumoniae以及三種革蘭氏陰性細(xì)菌綠膿桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens和大腸桿菌Escherichia coli對(duì)含S.symbiotica和不含S.symbiotica的兩個(gè)品系蚜蟲進(jìn)行感染，比較其存活率，發(fā)現(xiàn)S.symbiotica的有無對(duì)于6種細(xì)菌感染下的蚜蟲的存活率均無顯著影響。球孢白僵菌Beauveria bassiana感染后的兩個(gè)品系的蚜蟲的存活率也無顯著差異。檢測細(xì)菌感

8、染以后豌豆蚜體內(nèi)共生菌的密度發(fā)現(xiàn)，S.symbiotica在蚜蟲感染不同細(xì)菌后均升高約2-3倍，而專性共生菌B.aphidicola僅在蚜蟲感染革蘭氏陽性菌（特別是藤黃微球菌）后顯著升高。相比細(xì)菌感染，球孢白僵菌的感染并不引起蚜蟲體內(nèi)S.symbiotica和B.aphidicola的密度的變化。這些結(jié)果表明，兼性共生菌S.symbiotica并不影響豌豆蚜對(duì)細(xì)菌和真菌侵染的敏感性。
　　綜合以上結(jié)果，我們初步證明了活性氧在豌豆蚜