白木香原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系與植物MiRNA功能瞬時(shí)驗(yàn)證體系的建立.pdf

1、本研究首先利用白木香莖段及幼葉誘導(dǎo)白木香愈傷組織，然后分別處理了白木香愈傷與葉片，通過改變酶液濃度、組織的量、材料處理方式、酶解時(shí)間等因素探索并構(gòu)建了一個(gè)有效的白木香原生質(zhì)體游離體系。然后從白木香愈傷組織中提取總RNA，采用特異引物RT-PCR方法克隆倍半萜合酶ASS基因，并連接于pEZS-NL載體和pFGC5941GFP改造載體上，分別構(gòu)建pFGC5941-GFP-ASS、pEZS-NL-ASS-GFP兩種植物表達(dá)載體，分別利用PEG

2、轉(zhuǎn)化白木香原生質(zhì)體、農(nóng)桿菌侵染煙草葉片、基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞三種技術(shù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡下觀察表達(dá)出的綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白的表達(dá)并比較三種方法不同的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，將ASS導(dǎo)入白木香原生質(zhì)體、煙草葉片表皮細(xì)胞及洋蔥表皮細(xì)胞中，融合蛋白綠色熒光均能被觀察到，但其在三種體系中的表達(dá)量不同，在煙草表皮細(xì)胞中的表達(dá)量最高。與此同時(shí)融合蛋白在白木香原生質(zhì)體的胞質(zhì)及質(zhì)體定位較清晰，白木香倍半萜合酶ASS在胞質(zhì)及質(zhì)體

3、定位，與其他植物中倍半萜合酶亞細(xì)胞定位的推測(cè)及研究相符。
　　研究中還選用雙元表達(dá)載體pCAMBIA1200（插入煙草花葉病毒雙35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)）與pFGC5941GFP改造載體分別用于miRNA和潛在的靶基因與綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白的農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)，通過觀察GFP融合蛋白的熒光，驗(yàn)證miRNA對(duì)潛在靶基因表達(dá)的影響。為驗(yàn)證這一體系的有效性，選取擬南芥已知功能的miR393及其可以抑制的靶基因AFB3，分別構(gòu)建pCAMBI

4、A1200-35 S-miR393載體和pFGC5941-GFP-AFB3載體。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的三種方法中，農(nóng)桿菌侵染煙草葉片法的效率最高，因此利用該技術(shù)進(jìn)行pCAMBIA1200-35 S-miR393、pFGC5941-GFP-AFB3兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)和pFGC5941-GFP-AFB3單轉(zhuǎn)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)。只將AFB3導(dǎo)入煙草表皮細(xì)胞，可觀察到綠色熒光;而將miR393與AFB3同時(shí)導(dǎo)入煙草

5、表皮細(xì)胞后，未能觀察到綠色熒光。表明miR393抑制了AFB3的表達(dá)。因此，基于農(nóng)桿菌注射法的煙草（Nicotiana tabacum）瞬時(shí)表達(dá)體系能夠作為植物miRNA功能的活體瞬時(shí)驗(yàn)證體系，為miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)功能提供簡(jiǎn)單、快速、有效的證據(jù)，為今后研究藥用植物中其它miRNA與其靶基因提供了簡(jiǎn)便可靠的體系。
　　本研究成功構(gòu)建白木香葉片和愈傷原生質(zhì)體游離體系，并實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因在白木香愈傷原生質(zhì)體的PEG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化與表達(dá);進(jìn)