兒茶素在小鼠體內(nèi)代謝動力學(xué)及其對代謝酶CYP3A4和芳香化酶作用研究.pdf

1、兒茶素生物活性研究如今方興未艾,其抗氧化、抗癌等活性功能的實現(xiàn)依賴于兒茶素體內(nèi)良好的代謝動力學(xué)(吸收、分布、代謝、排泄)特征和較高的生物利用度水平。因此,考察兒茶素在體內(nèi)的動態(tài)變化過程,評價其吸收、分布與代謝消除等代謝動力學(xué)特征,增強口服生物利用度,并探索其對相關(guān)代謝酶作用,為今后茶葉及相關(guān)產(chǎn)品的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。目前國內(nèi)外學(xué)者對于兒茶素的研究主要集中于其有效成分的提取純化以及藥理活性等方面的研究,關(guān)于兒茶素在體內(nèi)外代謝規(guī)律以及對代

2、謝酶干擾機制方面研究,至今報道較少。
　　本課題以成年ICR小鼠為研究對象,建立了小鼠血漿、肝臟、脾臟、睪丸等組織液中兒茶素EGCG的反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測方法,同時比較了兒茶素EGCG在這些組織中代謝動力學(xué)和消除特征,探索了兒茶素EGCG在不同組織中分布消除規(guī)律。同時利用熒光定量 PCR、熒光免疫組織化學(xué)等分子生物學(xué)手段探索了兒茶素對代謝酶 CYP3A4和芳香化酶的作用。最后,利用建立的檢測方法及已闡明的代謝動力

3、學(xué)規(guī)律,就制備生物利用度增強型的兒茶素口服液進行了進一步探索。
　　1、兒茶素EGCG在小鼠體內(nèi)代謝動力學(xué)和組織分布研究
　　采用SPF級的成年ICR雄鼠,EGCG腹腔注射后,不同時間點采集組織,收集糞便、尿液、組織及排泄物,經(jīng)勻漿、液-液萃取后,利用所建立的HPLC分析方法檢測其中EGCG含量,計算兒茶素EGCG在體內(nèi)分布消除規(guī)律。結(jié)果表明:(1)建立的HPLC檢測方法在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999),平均回收率

4、85％以上,日內(nèi)和日間精密度均低于10.0%。(2)對兒茶素在小鼠體內(nèi)血漿及各組織的代謝及分布消除特征進行比較,發(fā)現(xiàn)EGCG在小鼠血漿、肝臟、脾臟和睪丸中均有分布,消除均較快,0-24h從糞便和尿液中消除的EGCG占總給藥量的10%以下。其代謝類型主要是I相水解反應(yīng),在小腸和肝臟中有II相結(jié)合產(chǎn)物。通過兒茶素EGCG在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)和組織分布研究,表明兒茶素EGCG在小鼠組織中分布廣泛,消除較快,從糞便和尿液中排泄較少,大部分

5、被體內(nèi)代謝。
　　2、兒茶素的小鼠體內(nèi)代謝動力學(xué)性別差異性及急性肝損傷
　　利用SPF級的ICR雌、雄小鼠(25±2g),采用上述已建立的RP-HPLC法檢測給藥后雌雄小鼠血液中EGCG濃度,利用藥物動力學(xué)公式計算代謝動力學(xué)參數(shù),結(jié)果表明雄性小鼠較雌性對EGCG代謝消除更加迅速,消除半衰期更短。代謝研究結(jié)果顯示羧酸酯酶II為EGCG發(fā)生代謝反應(yīng)的主要酶類,熒光免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明小鼠肝細胞中羧酸酯酶II含量的性別差異,雄

6、性小鼠體內(nèi)含量較雌性高,進一步解釋了EGCG在雄性小鼠體內(nèi)消除較快的原因。
　　試劑盒檢測給藥后小鼠血清酶活性變化,結(jié)果顯示:雌雄小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)均顯著升高(P<0.05),雌性較雄性小鼠顯著(P<0.01),琥珀酸脫氫酶(SDH)和鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)含量變化均不顯著。熒光酶標儀檢測肝線粒體膜電位變化,雌性小鼠肝細胞線粒體膜電位變化較雄性小鼠顯著,說明兒茶素EGCG對雌性小鼠肝損傷較

7、嚴重,與上述代謝動力學(xué)研究結(jié)果相一致。
　　3、兒茶素對肝代謝酶CYP3A4和睪丸芳香化酶的作用研究
　　本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測兒茶素對小鼠肝臟藥物代謝酶CYP3A4和睪丸間質(zhì)細胞中芳香化酶mRNA的影響,同時采用熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)分析其對相關(guān)酶蛋白表達的影響。研究結(jié)果表明兒茶素EGCG能夠顯著誘導(dǎo)肝臟中藥物代謝酶CYP3A4基因表達,同時對小鼠睪丸組織間質(zhì)細胞中芳香化酶基因表達具有顯著抑制作用。
　　4、生

8、物利用度增強型兒茶素口服液制備及其代謝動力學(xué)參數(shù)計算
　　通過對不同輔料篩選,表明聚乙二醇400(PEG-400)能夠顯著提高兒茶素口服生物利用度,故使用 PEG-400制備生物利用度增強型兒茶素口服液,然后對其在小鼠體內(nèi)口服生物利用度進行評價。利用整體小腸吸收模型,通過定量檢測口服后兒茶素 EGCG在小鼠血漿中濃度,建立血藥濃度—時間曲線方程,利用3P97藥物動力學(xué)軟件計算血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)。結(jié)果顯示所得血漿中

9、EGCG在0.1-200mg/L濃度范圍內(nèi)標準曲線為 Y=12037x+560.3(r=0.9999),在標準曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度兒茶素 EGCG回收率均達到85%以上,日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%。AUC計算結(jié)果表明口服液 AUC為9505.56mg·min/L,顯著高于片劑對照組 AUC(294.08mg·min/L),說明輔料 PEG-400作為兒茶素 EGCG在小腸中的吸收促進劑,能夠明顯促進兒茶素通過小腸上皮進行血液