鄂西北地區(qū)4種柴胡屬植物分子鑒別及柴胡藥材活性成分近紅外定量方法研究.pdf

1、目的：本研究旨在運用DNA條形碼、高分辨熔解曲線、HPLC和近紅外光譜四種技術(shù)對鄂西北地區(qū)柴胡種及質(zhì)量兩方面進(jìn)行分析，為柴胡種快速鑒別和質(zhì)量分析提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：（1）采集鄂西北地區(qū)柴胡屬植物北柴胡、狹葉柴胡、竹葉柴胡和三島柴胡等4種植物樣品。提取植物總DNA利用ITS序列和psbA-trnH序列PCR擴增，產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng) CodonCode Aligner9.5軟件進(jìn)行拼接， MEGA6.06軟件對最終序列進(jìn)行分析，基于

2、K2P模型構(gòu)建NJ樹。（2）將4種12份柴胡屬植物DNA樣品，用ITS2通用引物建立柴胡熔解曲線模型，并對4種柴胡屬植物進(jìn)行定性鑒別。（3）收集市場銷售柴胡藥材48批HPLC法測定柴胡皂苷a、d含量，考察柴胡質(zhì)量（4）對58批柴胡藥材進(jìn)行近紅外光譜采集，以HPLC法測定柴胡皂苷a、d含量數(shù)據(jù)作為參考，首先使用K-S算法將58批柴胡樣品劃分為訓(xùn)練集和驗證集，篩選出光譜最佳預(yù)處理方法，特征譜段以及SVM模型優(yōu)化方法。分別利用PLS算法和SV

3、M算法將訓(xùn)練集柴胡藥材近紅外光譜數(shù)據(jù)分別與柴胡皂苷a、d含量參考值進(jìn)行匹配，建立定量分析回歸模型。
　　結(jié)果和結(jié)論：（1）鄂西北柴胡屬植物ITS序列長度在534-536bp，種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離。4種柴胡屬植物NJ樹各為獨立一支，均能得到良好區(qū)分。psbA-trnH序列長度在443bp左右，種內(nèi)最大遺傳距離大于種間最小遺傳距離，無法用于鑒別4種柴胡屬植物。因此ITS序列作為DNA條形碼，對鄂西北4種柴胡屬植物具有良

4、好的鑒別能力。（2）4種柴胡屬樣品進(jìn)行HRM實驗分析，發(fā)現(xiàn)4種柴胡屬DNA樣品熔解曲線均為單峰且各種樣品 Tm值彼此分開。北柴胡熔解曲線 Tm為（89.40±0.04）℃；狹葉柴胡熔解曲線Tm為（89.97±0.07）℃；竹葉柴胡熔解曲線Tm為（89.28±0.04）℃；三島柴胡熔解曲線Tm為（89.74±0.08）℃。利用此模型，比較熔解曲線峰型和Tm值即可對4種柴胡屬植物進(jìn)行鑒別。（3）實驗結(jié)果表明，除4、9、30號樣品外，其他樣品

5、柴胡皂苷a、d總含量均符合《中國藥典》（2015版）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（4）近紅外定量分析柴胡確定了：以 FD+MSC為預(yù)處理方法，8750～6000cm-1范圍光譜為最佳譜段，網(wǎng)格尋優(yōu)法為最佳優(yōu)化方法的柴胡皂苷a定量分析模型；無預(yù)處理光譜，以8750～6000cm-1，4500～4100cm-1為最適譜段，GA法為最佳優(yōu)化方法的柴胡皂苷 d定量分析模型。兩個分析模型 RMSECV值分別為1.2471和1.4956，對柴胡皂苷a、d的定量分析有