電針預(yù)處理通過MMP9調(diào)節(jié)TJP誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的研究.pdf

1、背景:
　　根據(jù)《2014年中國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒》公布的結(jié)果，缺血性腦卒中依然是威脅我國(guó)國(guó)民健康的主要疾病之一。結(jié)合我國(guó)現(xiàn)階段醫(yī)療情況，其具有發(fā)病率高、患病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，給社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。而目前臨床對(duì)于卒中的治療主要是依靠組織型纖溶酶原激活物(tPA)，但由于嚴(yán)格的治療時(shí)間窗、出血風(fēng)險(xiǎn)及知情同意等諸多限制，絕大部分患者沒有得到及時(shí)有效的治療。因此，研究缺血性卒中發(fā)生機(jī)制并尋找新的治療措施成為亟需解決的問題

2、。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)超家族的成員之一，目前大量的研究證實(shí)其在被激活后通過參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解過程，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MMP9被認(rèn)為是與腦微血管疾病關(guān)系最為密切的酶之一。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可逆轉(zhuǎn)缺血后緊密連接蛋白(TJP)的降解作用，使腦水腫程度明顯減輕。這一結(jié)果提示血腦屏障(BBB)組成成分的TJP與MMP9可能存在某種聯(lián)系。而另一研究

3、發(fā)現(xiàn)敲除MMP9基因的小鼠，腦缺血后的梗死容積顯著降低。此外，有試驗(yàn)通過腹腔內(nèi)注射褪黑素使大鼠缺血再灌注損傷后腦內(nèi)MMP9的水平明顯降低，BBB破壞較輕，腦水腫程度改善。這一系列結(jié)果說明，腦卒中后MMP9水平的升高與活化會(huì)促使TJP降解，引起B(yǎng)BB通透性改變導(dǎo)致腦水腫，加重腦組織損傷。而采取有效措施降低卒中后MMP9的表達(dá)與活化將有助于減輕TJP降解，從而緩解腦水腫，改善卒中轉(zhuǎn)歸。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)在缺血再灌注損傷后有著錯(cuò)綜復(fù)雜的

4、調(diào)控機(jī)制，我科多年來致力于電針的腦保護(hù)作用研究，本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用與腦組織內(nèi) MMP9的水平與活性密切相關(guān)[8]。但對(duì)這一現(xiàn)象潛在的細(xì)胞分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，因此進(jìn)一步探索電針預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。
　　結(jié)合以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，觀察持續(xù)電針預(yù)處理后缺血區(qū)腦組織炎癥反應(yīng)—MMP9表達(dá)—TJP完整性—BBB通透性等一系列變化并初步探索其

5、內(nèi)在機(jī)制，希望能夠?qū)﹄娽橆A(yù)處理誘導(dǎo)缺血耐受的機(jī)制有更深刻的認(rèn)識(shí)，為針對(duì)MMP9治療腦中風(fēng)帶來新的視角與契機(jī)。
　　實(shí)驗(yàn)一、持續(xù)電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷和BBB通透性的影響
　　目的：驗(yàn)證持續(xù)電針預(yù)處理對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用；觀察預(yù)處理及缺血后BBB通透性和腦水含量變化情況。
　　方法：
　　①持續(xù)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用
　　健康雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分4組：假手術(shù)組(Sham，n=8)、單純電針預(yù)處

6、理組(EA，n=8)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(MCAO，n=8)及電針預(yù)處理復(fù)合缺血再灌注組(EA+MCAO，n=8)。MCAO組及EA+MCAO組大鼠行MCAO后2h恢復(fù)再灌注，于再灌注后48h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并處死取腦行TTC染色檢測(cè)梗死容積。
　?、陔娽橆A(yù)處理對(duì)腦缺血再灌后BBB通透性的影響
　　健康雄性SD大鼠96只，隨機(jī)分4組：Sham組(n=24)、EA組(n=24)、MCAO組(n=24)及EA+MCAO組(n=2

7、4)。再將每組隨機(jī)分為4個(gè)批次，電針預(yù)處理5天、缺血2小時(shí)、再灌注48小時(shí)候后按不同要求取材。分別檢測(cè)各組動(dòng)物伊文斯藍(lán)(Evans Blue,EB)在腦實(shí)質(zhì)中的擴(kuò)散、EB滲透率和腦水含量。其中EB于再灌注后的第46小時(shí)經(jīng)尾靜脈注入。
　　結(jié)果：①持續(xù)電針預(yù)處理具有誘導(dǎo)腦缺血耐受的作用。與MCAO組相比，EA+MCAO組動(dòng)物腦梗死容積減少，神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分有所改善(Ρ<0.05)；②電針預(yù)處理減輕了BBB破壞，降低了腦水腫程度。相較于

8、MCAO組，EA+MCAO組動(dòng)物梗死側(cè)腦組織內(nèi)EB透過則明顯減少(P<0.05)，同時(shí)EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦內(nèi)腦水含量較MCAO組顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：電針預(yù)處理能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受，這一作用的發(fā)揮與其保持缺血損傷后BBB完整性關(guān)系密切。
　　實(shí)驗(yàn)二、電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注后MMP9表達(dá)和活性的影響
　　目的：證實(shí)電針預(yù)處理能夠通過降低缺血再灌后腦內(nèi)MMP9的表達(dá)水平和活性發(fā)揮腦保護(hù)作用。

9、　　方法：健康雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為4組(n=18)：Sham組、EA組、MCAO組及EA+MCAO組。于再灌注48h處死，按實(shí)驗(yàn)要求取梗死側(cè)及對(duì)側(cè)腦組織，使用免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印記及明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)MMP9的活性及表達(dá)情況。為了排除假陽性，在免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)中另設(shè)陰性對(duì)照組(Ab-)。結(jié)果：免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印記及明膠酶譜試驗(yàn)均表明相較于MCAO組，EA+MCAO組大鼠在半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)域MMP

10、9的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，活性明顯降低(P<0.05)。而各組動(dòng)物非梗死側(cè)腦組織內(nèi)MMP9含量及活性無明顯差異。
　　結(jié)論：持續(xù)電針預(yù)處理能夠降低缺血再灌注后腦組織內(nèi)MMP9的水平及活性。
　　實(shí)驗(yàn)三、電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌后血腦屏障TJP的影響
　　目的：對(duì)血腦屏障TJP水平檢測(cè)，證實(shí)電針預(yù)處理能夠通過降低缺血后MMP9的表達(dá)使TJP水解程度減輕，發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。
　　方法：健康雄性SD大鼠30只，隨機(jī)

11、分為5組(n=6)：Sham組、EA組、MCAO組、EA+MCAO組及MMP9抑制劑復(fù)合缺血再灌注組(BB1101+MCAO)。根據(jù)分組進(jìn)行不同處理，其中BB1101+MCAO組于MCAO模型制作前30min腹腔注射BB1101（30mg/kg），再灌注48h后麻醉處死取半暗帶組織。使用Western blot分別檢測(cè)各組動(dòng)物腦內(nèi)三種緊密連接蛋白(Occludin、Claudin-5、ZO-1)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：對(duì)三種緊密連

12、接蛋白(Claudin-5、Occludin、ZO-1)分別檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)三種蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；而與MCAO組相比，EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)大腦皮層及紋狀體區(qū)的TJP水平則出現(xiàn)了顯著升高(P<0.05)；EA+MCAO組與BB-1101+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦內(nèi)三種蛋白表達(dá)在皮層與紋狀體區(qū)沒有明顯差異性，同時(shí)各組大鼠非梗死側(cè)腦組織均未檢測(cè)到這三種蛋白的明顯變化。<

13、br>　　結(jié)論：電針預(yù)處理通過抑制腦缺血后MMP9的上調(diào)，減輕了TJP水解，發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)四、電針預(yù)處理對(duì)缺血半暗帶區(qū)炎癥水平及NF-κB活性的影響
　　目的：前三部分實(shí)驗(yàn)表明電針預(yù)處理能夠通過抑制MMP9表達(dá)與活化，減輕TJP水解誘導(dǎo)腦缺血耐受，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從檢測(cè)電針預(yù)處理后腦缺血組織中的炎癥水平及NF-κB核轉(zhuǎn)位情況入手，探索電針預(yù)處理如何誘導(dǎo)缺血耐受，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：

14、健康雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為4組：Sham組(n=6)、EA組(n=6)、MCAO組(n=12)及EA+MCAO組(n=12)。再將MCAO組及EA+MCAO組隨機(jī)等分為兩個(gè)批次，其中第一批次按分組進(jìn)行電針預(yù)處理5d、缺血2h、再灌注48h后取材，使用ELISA法檢測(cè)炎癥因子(IL-1β、IL-10)及髓過氧化物酶(MPO)水平。另一批次與Sham及EA組合并，按分組要求預(yù)處理并在缺血2h、再灌注48h后取材，進(jìn)行核-漿蛋白分離抽提

15、后分別檢測(cè)其NF-κB亞基p65的核轉(zhuǎn)位情況。
　　結(jié)果：①運(yùn)用ELISA的方法檢測(cè)不同分組大鼠腦組織中炎癥因子表達(dá)水平及活性情況發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層和紋狀體的IL-1β水平明顯降低(P<0.05)而IL-10水平則大幅升高（P<0.05)，同時(shí)MPO活性顯著降低（P<0.05)。但兩組大鼠非梗死側(cè)腦組織內(nèi)IL-1β、IL-10水平及MPO活性無明顯差異。②通過核-漿蛋白分離提取和Weste

16、rn blot對(duì)大鼠梗死側(cè)腦組織不同腦區(qū)的核蛋白及漿蛋白進(jìn)行檢測(cè)。其中核蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)NF-κB亞基p65水平明顯增高(P<0.05)；與MCAO組相比，EA+MCAO組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層及紋狀體區(qū)p65明顯降低(P<0.05)；漿蛋白檢測(cè)結(jié)果則顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠缺血半暗帶的皮層及紋狀體區(qū)p65水平明顯降低(P<0.05)；與MCAO組相比，EA+MCA

17、O組大鼠梗死側(cè)腦組織皮層及紋狀體區(qū)p65水平則有所升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：電針預(yù)處理通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位減輕局部炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　總結(jié):
　　本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)電針預(yù)處理能夠通過抑制MMP9的上調(diào)與活化，從而減輕TJP的降解，維持BBB完整性，誘導(dǎo)腦缺血耐受作用。另外還初步證明電針預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制與其抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位減輕局部炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。這提示電針預(yù)處理可成為臨床減輕局部炎癥反應(yīng)，治療