表面修飾的金納米顆粒攜帶血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子透皮轉(zhuǎn)運(yùn)研究.pdf

1、目的：
　　表面透皮給藥系統(tǒng)(Transdemal drug delivery systems TDDS)，是指直接在皮膚表面通過(guò)涂抹覆蓋的方式給藥，使藥物通過(guò)皮膚吸收進(jìn)入皮下，產(chǎn)生全身或局部治療作用的一種新型藥物輸送途徑，屬于無(wú)創(chuàng)傷性給藥方式。透皮給藥作為一類(lèi)特殊的給藥途徑，與傳統(tǒng)的給藥方式（口服和注射）相比，其優(yōu)勢(shì)明顯：1、可以避免藥物在胃酸條件下水解失活，減少與消化酶接觸的機(jī)會(huì);2、可避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)，從而達(dá)到更好的藥物效

2、應(yīng)，并減少用藥個(gè)體差異;3、可以隨時(shí)撤銷(xiāo)用藥。
　　如何治療由燒傷或輻射造成皮膚損傷在臨床上仍是一個(gè)棘手的問(wèn)題。皮膚大面積深度壞損，無(wú)法愈合，需要通過(guò)植皮以修復(fù)創(chuàng)面。但由于皮下血管的毀壞，植皮后的創(chuàng)面得不到充足的血液供應(yīng)而難以愈合。因此恢復(fù)病灶區(qū)域的血液供應(yīng)是修復(fù)受損皮膚的必要條件。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)由于其特有的高效促血管生成作用，誘導(dǎo)觸發(fā)新的血管的內(nèi)皮細(xì)胞生成，新生血管能恢復(fù)皮膚局部血供，提供表皮和真皮細(xì)胞再生所需營(yíng)養(yǎng)

3、物質(zhì)，從而促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)，恢復(fù)屏障功能。然而，傳統(tǒng)給藥的方法不能使VEGF準(zhǔn)確有效地到達(dá)表皮和真皮，且維持其蛋白結(jié)構(gòu)，保持原有生物活性。將VEGF通過(guò)透皮給藥方式，穿過(guò)皮膚的屏障，到達(dá)皮下促進(jìn)血管生成，可能成為有效的治療皮膚損傷的方法。
　　最近，納米粒子(NPs)介導(dǎo)的透皮載藥技術(shù)引起了大量的關(guān)注。其中金納米顆粒作為藥物載體，可以改變膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，增加藥物的細(xì)胞膜滲透性，藥物經(jīng)皮吸收后能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在本文中，我們

4、合成了具有不同表面電荷的金納米顆粒，評(píng)估它們的透皮效率，發(fā)現(xiàn)表面帶負(fù)電荷的金納米顆粒具有高效的透皮效率。VEGF通過(guò)生物鏈接金納米顆粒后，其連接合成產(chǎn)物表面仍帶負(fù)電荷。VEGF連接金納米顆粒后，金納米顆粒作為藥物載體可以促使VEGF透過(guò)皮膚屏障，進(jìn)入皮下，并維持其生物活性，誘導(dǎo)血管生成。我們的研究結(jié)果可以為皮膚損傷治療提供新的方向。
　　方法：
　　1.AuNPs合成方法及AuNPs的表面修飾
　　利用檸檬酸緩沖體系還

5、原制備AuNPs，之后加入SH-PEG-COOH，SH-PEG-NH2和PEG-SH三種不同的聚乙二醇修飾劑，獲得表面有不同官能團(tuán)的金納米顆粒(citrate-AuNP,AuNP-PEG-OCH3,AuNP-PEG-COOH和AuNP-PEG-NH2)。
　　2.在體實(shí)驗(yàn)研究AuNPs的透皮效果
　　選用Balb/c小鼠（雌，6～7周），背部剃毛處理，建立動(dòng)物模型。將300μL的不同表面修飾的納米金顆粒(citrate-Au

6、NP、AuNP-PEG-OCH3、AuNP-PEG-COOH、AuNP-PEG-NH2)溶液（2×1010/mL，1.44μM）滴加在紗布上，覆蓋脫毛處理后裸露的皮膚24h。然后取皮，制片，用于TEM觀(guān)察和銀染處理后觀(guān)察。
　　3.MTT試驗(yàn)
　　選擇Balb/c3T3細(xì)胞評(píng)估AuNP-PEG-COOH的細(xì)胞毒性。
　　4.AuNP-PEG-COOH與VEGF的連接
　　AuNP-PEG-COOH調(diào)整濃度為2×1

7、011/mL，利用EDC/sulfo-NHS試劑將VEGF(連接了His標(biāo)簽，濃度為20μg/mL)與AuNP-PEG-COOH連接，得到合成產(chǎn)物AuNP-CONH-VEGF。
　　5.在體實(shí)驗(yàn)研究AuNP-CONH-VEGF的透皮效果
　　運(yùn)用上述動(dòng)物模型，在無(wú)菌紗布上滴加300μL的AuNP-CONH-VEGF懸浮液，覆蓋裸露皮膚24h。24h后，取皮制片，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF是否透過(guò)皮膚屏障進(jìn)入皮下。同樣動(dòng)物

8、模型，透皮處理7天之后，取皮制片，用免疫組化染色和H&E染色，進(jìn)一步研究透皮后的VEGF能否促進(jìn)皮下血管生成。
　　結(jié)果：
　　1.檸檬酸鈉還原法合成的AuNPs，AuNPs的直徑約11.2±0.1nm，為幾何學(xué)球形且呈分散性。修飾后的金納米顆粒，AuNP-PEG-OCH3（表面電中性），AuNP-PEG-COOH（表面帶負(fù)電荷），AuNP-PEG-NH2（表面帶正電荷）。
　　2.不同表面修飾的AuNPs透皮處理后，

9、在皮膚表皮層真皮層均均發(fā)現(xiàn)納米金顆粒。TEM圖片只能定性地證明表面帶不同電荷的AuNPs可以透過(guò)皮膚屏障進(jìn)入皮下。我們將相同實(shí)驗(yàn)方法下得到的皮膚樣本進(jìn)行sliver-enhanced染色，以對(duì)表面帶不同電荷的AuNPs的透皮效率進(jìn)行探討。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，表面帶負(fù)電荷的AuNPs，即AuNP-PEG-COOH組銀染圖片內(nèi)的銀染顆粒多于其他組。
　　3.在10μM～50μM的濃度范圍內(nèi)AuNPs安全等級(jí)是1，具有較低的細(xì)胞毒性。

10、　　4.AuNPs與VEGF結(jié)合后(AuNP-CONH-VEGF)，表面電荷仍然是負(fù)電荷。
　　5.我們?cè)谕钙ぬ幚?4h后的小鼠皮膚中，通過(guò)免疫組化染色，檢測(cè)到了VEGF，而對(duì)照組未檢測(cè)出。7天后，運(yùn)用免疫組化染色和H&E染色，分析統(tǒng)計(jì)血管生成情況，發(fā)現(xiàn)皮膚表面施用AuNP-CONH-VEGF，即實(shí)驗(yàn)組，皮下的血管密度明顯高于對(duì)照組.
　　結(jié)論：
　　1.表面帶負(fù)電荷的AuNPs，即AuNP-PEG-COOH，具有最高