hWNK4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、前言：人類WNK4(Human With No lysine[K]kinase4,hWNK4)基因編碼一種特殊類型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,為WNK激酶(With No lysine[K]kinase,WNK)家族成員之一。由于該激酶家族成員在激酶結(jié)構(gòu)域缺乏其它激酶高度保守的賴氨酸而得名。該賴氨酸在其它激酶參與錨定ATP的α和β磷酸基團和隨后的激酶磷酸化作用,但WNK激酶的賴氨酸被半胱氨酸所替代后激酶的生物活性并沒有發(fā)生改變。hWNK4

2、基因定位于17q21.31,基因組全長約16kb,含有19個外顯子,cDNA全長為3861bp,編碼1231個氨基酸。hWNK4基因的錯義突變可導(dǎo)致一種遺傳性高血壓——Ⅱ型假性低醛固酮血癥(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM,No.145260),其主要臨床表現(xiàn)為高血壓和高血鉀。研究表明WNK4激酶主要表達在腎臟,通過調(diào)節(jié)腎臟遠曲小管和集合管上的多種離子轉(zhuǎn)運體和離子通道(如:Na-Cl共轉(zhuǎn)運體

3、[NaCl cotransporter,NCCT],腎外髓鉀離子通道[Renal OuterMedullary K+ Channel,ROMK],上皮鈉通道[Epithelial Sodium Channel,ENaC]等)參與機體水鹽代謝和血壓調(diào)節(jié)。目前關(guān)于hWNK4基因的研究主要集中在功能方面,而hWNK4基因表達調(diào)控機制以及上游調(diào)控因子仍不十分清楚。
　　 糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)在人體內(nèi)主要由腎上

4、腺分泌,是一種重要的生理調(diào)節(jié)因子,它通過調(diào)節(jié)各種類型細胞內(nèi)的基因表達行使其功能,在物質(zhì)代謝、水鹽平衡調(diào)節(jié)、細胞增殖和分化方面發(fā)揮重要作用。在臨床,GC是最常用藥物之一,但長期使用易引起水鹽代謝紊亂,導(dǎo)致高血壓。所以本研究擬通過分析GC對hWNK4基因表達的影響和作用機制來鑒定hWNK4基因是否是GC引起水鹽代謝紊亂的一個作用靶點。
　　 真核生物基因的近端啟動子區(qū)(-250～+250)通常含有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的重要順式作用元件。生物

5、信息學(xué)分析顯示hWNK4基因近端啟動子區(qū)無典型的TATA盒,但富含GC序列和一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子作用元件,如Sp1、AP-1和C/EBP等。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)hWNK4基因近端啟動子區(qū)一個關(guān)鍵的正性調(diào)控區(qū),因此本研究擬解析該正性調(diào)控區(qū)中所含的順式作用元件,從而進一步揭示hWNK4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、人胚腎細胞系HEK293,非洲綠猴腎細胞系COS-7及細胞培養(yǎng)相關(guān)

6、試劑2、Northern雜交,Real-time RT-PCR及Western印跡雜交相關(guān)試劑3、基因克隆及熒光素酶報告基因檢測相關(guān)分子生物學(xué)試劑4、電泳泳動遷移實驗(EMSA),染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP),DNA蛋白結(jié)合分析實驗相關(guān)試劑5、糖皮質(zhì)激素受體(Glucocortcoid receptor,GR)表達載體pRShGRα,Sp1表達載體pN3-Sp1,地塞米松(Dexamethasone,Dex,一種人工合成的GC),RU48

7、6(一種GR拮抗劑).
　　 二、實驗方法'1、Northern雜交檢測Dex刺激前后以及同時存在RU486情況下,HEK293細胞中hWNK4基因mRLNA表達變化;Real-time RT-PCR進一步驗證確認;
　　 2、克隆hWNK4基因啟動子序列(-484～+62),構(gòu)建熒光素酶報告基因載體p484-1uc,轉(zhuǎn)染COS-7細胞,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析COS-7細胞中單獨轉(zhuǎn)染GR,或單獨Dex刺激,或轉(zhuǎn)染GR

8、同時以不同濃度Dex刺激對hWNK4基因啟動子活性的影響;
　　 3、生物信息學(xué)分析hWNK4基因啟動子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,構(gòu)建系列截短的hWNK4基因啟動子熒光素酶報告基因載體,轉(zhuǎn)染HEK293,通過雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析hWNK4基因各段啟動子活性;
　　 4、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析HEK293中Dex刺激前后以及同時存在RU486對hWNK4基因啟動子活性的影響;
　　 5、EMSA體外鑒定hWNK4基因啟

9、動子內(nèi)激素反應(yīng)元件及Dex對GR與該反應(yīng)元件結(jié)合力的影響,ChIP體內(nèi)實驗進一步驗證確認;
　　 6、對hWNK4基因近端啟動子-275～+62區(qū)域構(gòu)建更為精細的系列截短的熒光素酶報告基因載體,轉(zhuǎn)染HEK293細胞,通過雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析,尋找hWNK4基因核心啟動子,并結(jié)合生物信息學(xué)分析確定對hWNK4基因基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用的潛在順式作用元件;
　　 7、對確定的潛在Sp1作用元件進行定點突變,構(gòu)建突變體熒

10、光素酶報告基因p241m-1uc,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析突變后啟動子活性變化,以確認其功能;
　　 8、DNA蛋白結(jié)合分析實驗體外鑒定Sp1作用元件,ChIP體內(nèi)實驗進一步驗證確認;
　　 9、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析RNA干涉敲減Sp1或瞬時轉(zhuǎn)染過表達Sp1對hWNK4基因啟動子活性的影響,Western印跡雜交檢測Sp1表達水平;
　　 10、Real-time RT-PCR檢測RNA干涉敲減Sp1或瞬

11、時轉(zhuǎn)染過表達Sp1對內(nèi)源hWNK4基因mRNA表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、Northern雜交和Real-time RT-PCR均顯示Dex刺激24h后,HEK293細胞中hWNK4基因mRNA表達下降為空白對照的28-35％,同時加入GR受體拮抗劑RU486可以使mRNA水平恢復(fù)至接近空白對照水平,提示Dex通過GR介導(dǎo)下調(diào)hWNK4基因表達。
　　 2、hWNK4基因啟動子報告基因p484-1uc轉(zhuǎn)

12、染COS-7細胞,熒光素酶活性分析顯示Dex呈GR依賴和劑量依賴方式抑制啟動子活性。
　　 3、生物信息學(xué)分析顯示hWNK4基因啟動子區(qū)無TATA盒,存在GR、Sp1、AP-1、GATA-1及C/EBP等多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子作用元件;系列截短的hWNK4基因啟動子報告基因熒光素酶活性分析提示hWNK4基因啟動子區(qū)-337～-326和-285～-276為兩個負調(diào)控元件,-484～-337,-325～-285和-275～+62為三個正

13、調(diào)控區(qū);
　　 4、Dex單獨或Dex和RU486共同刺激后,雙熒光素酶活性分析表明hWNK4基因啟動子區(qū)-337～-326和-285～-276兩個負調(diào)控元件與GC的抑制作用密切相關(guān)。
　　 5、EMSA和ChIP實驗分別在體外和體內(nèi)條件下證明GR結(jié)合到hWNK4基因啟動子-337～-326和-285～-276區(qū),并且Dex作用增強GR蛋白與這兩個位點的結(jié)合。
　　 6、熒光素酶報告基因表明hWNK4基因啟動子-

14、241～-202區(qū)域為核心啟動子;生物信息學(xué)分析顯示該區(qū)域存在一個潛在Sp1作用元件(-223～-214);
　　 7、突變Sp1作用元件(-223～-214)使hWNK4基因啟動子活性顯著下降;
　　 8、DNA蛋白結(jié)合分析實驗和ChIP實驗分別在體外和體內(nèi)條件下證明-223～-214序列為Sp1作用元件。
　　 9、RNAi敲減Sp1,hWNK4基因啟動子活性降低;過表達Sp1,hWNK4基因啟動子活性升高;

15、
　　 10、RNAi敲減Sp1,內(nèi)源hWNK4基因mRNA表達降低;過表達Sp1,內(nèi)源hWNK4基因mRNA表達升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、糖皮質(zhì)激素下調(diào)hWNK4基因轉(zhuǎn)錄,該下調(diào)作用由hWNK4基因啟動子區(qū)的兩個負性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(-337～-326和-285～-276)介導(dǎo)。
　　 2、轉(zhuǎn)錄因子Sp1上調(diào)hWNK4基因轉(zhuǎn)錄,hWNK4基因啟動子-241～-202區(qū)域為核心啟動子,該區(qū)域內(nèi)存在