骨髓間充質干細胞影響慢性粒細胞白血病K562細胞株增殖、凋亡及對伊馬替尼敏感性的研究.pdf

1、目的：
　　慢性粒細胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia,CML）是一種起源于多能造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病。其特點是存在能夠編碼具有較強酪氨酸激酶活性蛋白的 Ph染色體以及 Bcr-Abl融合基因。酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI）作為其靶向藥物，療效顯著。但是隨著疾病的進展以及治療期的延長，另一嚴峻問題逐漸顯現—TKIs耐藥。骨髓微環(huán)境（Bone Marro

2、w Micro-environment）是造血干細胞生長發(fā)育的主要場所，與腫瘤的發(fā)生、進展及耐藥有著密不可分的聯(lián)系。間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）作為骨髓腫瘤微環(huán)境（tumor micro-environment）中的最重要的基質細胞之一，在這過程中扮演重要角色。因此，我們在體內外條件下研究CML患者來源骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-

3、MSCs）對慢性髓細胞白血病細胞株K562增殖能力、凋亡水平及對伊馬替尼（Imatinib,IM）敏感性的影響，以初步探討B(tài)M-MSCs影響慢性粒細胞白血病進展及耐藥的機制，為緩解、甚至逆轉CML對IM耐藥提供實驗基礎。
　　方法：
　　收集CML患者骨髓標本，利用密度梯度離心法結合貼壁分離篩選法提取 BM-MSCs，并通過 H-E染色進行形態(tài)學鑒定，通過傳代純化細胞。將BM-MSCs與K562細胞以不同比例接觸共培養(yǎng)，繪制

4、K562細胞生長曲線，并利用流式細胞術檢測K562細胞凋亡水平及所處細胞周期。將BM-MSCs與K562細胞種植于 BALB/C裸鼠右側腋窩皮下，觀察裸鼠皮下瘤成瘤情況，繪制生長曲線。皮下瘤形成2周后每日灌胃給藥IM，4周后處死裸鼠，計算體積抑瘤率。應用H-E染色及TUNEL染色實驗檢測腫瘤凋亡情況，計算壞死評分和凋亡指數。利用免疫熒光技術及Western Blot檢測皮下瘤內生存、凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及I

5、L-7R/Jak/Stat5信號通路相關蛋白IL-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、pJak-1、pJak-3、pStat5的表達水平。
　　結果：
　　1.細胞形態(tài)學顯示：首次分離獲得的人BM-MSCs細胞體積大，胞漿與胞核的比例高，呈紡錘形、多角形或橢圓形，有長短不齊的突起。貼壁生長，相互間獨立，部分呈漩渦狀、輻射狀分布，形成成纖維樣細胞集落。隨著代數增加BM-MSCs得到純化。2-3代后BM-MSCs具有典型的

6、MSCs形態(tài)特征，呈較均一長梭形，核漿比例大，細胞間緊密貼附，呈魚群狀分布。
　　2.BM-MSC抑制K562細胞增殖：
　　①在體外環(huán)境下，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，K562細胞生長速度減慢。
　?、谠隗w內環(huán)境下，相比 K562細胞組皮下瘤，K562+BM-MSCs組皮下瘤終體積、終重量減小（2.63±0.06 vs.1.97±0.04，P＜0.05）。
　　3.BM-MSCs抑制K562細胞凋亡：
　　

7、①在體外環(huán)境下，將K562細胞與BM-MSCs分別以100：1、10：1、5：1、1：1的比例共培養(yǎng)48h。流式結果顯示，加入BM-MSCs后K562細胞凋亡減少。并且隨著BM-MSCs濃度的增加，凋亡水平逐漸降低。
　?、谠隗w內環(huán)境下，相比K562細胞組，K562細胞+BM-MSCs組皮下瘤凋亡、壞死程度減輕（凋亡指數8.98±0.06％vs.5.08±0.01％，壞死評分2.25±0.25 vs.1.5±0.33，P＜0.05

8、）。免疫熒光及Western blot結果也提示K562細胞+BM-MSCs組皮下瘤凋亡相關蛋白 Bcl-2蛋白表達量增加、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達量降低（P＜0.05）。
　　4.BM-MSCs阻滯K562細胞于G0/G1期：在體外環(huán)境下，將K562細胞與BM-MSCs分別以100：1、10：1、5：1、1：1的比例共培養(yǎng)48h。流式結果顯示，隨著BM-MSCs比例的升高，處于G0/G1期的K562細胞逐漸增多。<

9、br>　　5.BM-MSCs降低K562細胞對IM的敏感性：相比K562細胞+IM組，K562細胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤終重量減輕（1.57±0.02g vs.1.17±0.06g，P＜0.05），抑瘤率降低（53.76±0.01％ vs.13.20±1.90％，P＜0.05），壞死程度增加（壞死評分0.25±0.25 vs.1.25±0.25，凋亡指數0.09±0.02％ vs.2.39±0.07％，P＜0.05）。免疫熒光及

10、Western blot結果提示，相比K562細胞+IM組，K562細胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤內凋亡相關蛋白Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。
　　6.IL-7R/Jak/Stat5信號通路與BM-MSCs降低K562細胞對IM敏感性過程具有相關性：免疫熒光及Western blot結果顯示，相比K562細胞+IM組，K562細胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤內IL

11、-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、pJak-1、pJak-3、pStat5蛋白水平升高（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.CML患者來源BM-MSCs可以降低CML細胞凋亡、增殖水平，使細胞長期處于靜息狀態(tài)，增加其生存能力。
　　2.CML患者來源BM-MSCs降低CML細胞對IM的敏感性。
　　3.L-7R/Jak/Stat5信號通路有可能參與介導了BM-MSCs降低CML細胞對IM敏感性的過程。