厚殼貽貝多糖的提取工藝優(yōu)化及體外生物活性研究.pdf

1、目的：本文以活性為指導(dǎo)優(yōu)化提取工藝，從浙江舟山的厚殼貽貝（Mytilus coruscus）體內(nèi)多糖的提取和活性等方面進行研究，為分析貽貝多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究提供依據(jù)。
　　方法：采用熱水提取，兩步聯(lián)合酶解法（木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）分別提取得到貽貝粗品，貽貝多糖粗品經(jīng)DEAE－cellulose52柱層析得到3個組分（MT1、MT2、MT3），又分別經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾層析分離純化貽貝多糖后，共得5個組分（MT

2、1-1、MT1-2、MT2-1、MT2-2、MT3-1），分析多糖的基本理化性質(zhì)，對包括比較其總糖含量、Bradford法蛋白含量、糖醛酸和硫酸根含量在內(nèi)的糖的基本理化性質(zhì)進行分析測定。并采用柱前衍生高效液相色譜法和高效凝膠滲透色譜法分別對RT、MT和MT3的單糖組成及相對分子質(zhì)量進行測定。并通過紅外光譜技術(shù)進行結(jié)構(gòu)分析后，解析的基礎(chǔ)上對MT1進行硫酸化和磷酸化結(jié)構(gòu)修飾后，采用體外試驗研究各個組分對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的

3、清除能力以及通過 MTT法測定抗前列腺癌 DU-145細胞和人肺癌H1299細胞的活性，并通過HE染色及AO/EB染色熒光顯微鏡分別觀察多糖作用下兩種細胞的基本形態(tài)及流式細胞儀檢測多糖作用前后DU-145和H1299細胞的早期凋亡率，為深入研究貽貝多糖的生物活性提供重要依據(jù)。
　　結(jié)果：通過對熱水提取法，木瓜蛋白酶提取法，胰蛋白酶提取法和聯(lián)合酶提取法得到的貽貝多糖粗品進行理化性質(zhì)分析和活性篩選，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合酶解提取得到的貽貝粗多糖得率

4、、純度和生物活性上均優(yōu)于其他方法提取得到的粗多糖。經(jīng)過進一步正交試驗，確定兩步聯(lián)合酶水解法提取厚殼貽貝多糖的最佳提取條件，即提取溫度60℃，最適反應(yīng)時間3 h，料液比1:20，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的加酶量分別為1％和0.5%，最適pH值分別為7，10，粗多糖的產(chǎn)率為23.69%。通過分離純化后對各組分的得率和組成分析表明：聯(lián)合酶提可提高貽貝多糖類糖胺聚糖的含量達到13.5%，其單糖組成主要為Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc，

5、分子量約為18 kD。體外抗氧化結(jié)果：酶提多糖 MT在濃度為10 mg/mL時對DPPH的清除率分別為84.18%，EC50分別為3.75 mg/mL；對超氧陰離子自由基清除率分別為83.96%，EC50為5.01 mg/mL；對脂質(zhì)過氧化物的清除率到達82.33%，對脂質(zhì)過氧化物清除的EC50為2.41 mg/mL。對純化后各組分進行抗腫瘤活性篩選，和其他組分相比，MT3-1組分表現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性，對體外前列腺癌DU-145細

6、胞和人肺癌H1299細胞抑制率分別最高達88.39%和89.04%，48 h IC50分別為2.71 mg/mL，2.415 mg/mL。以上2種細胞經(jīng)HE染色后，可見細胞形態(tài)不規(guī)則，巨核細胞增多，染色質(zhì)凝聚、核固縮等凋亡的形態(tài)學(xué)改變。AO/EB雙染在熒光顯微鏡下比較觀察，對照組無明顯凋亡細胞，MT3-1經(jīng)24 h作用，隨樣品低中高濃度時，凋亡細胞逐漸增多。作用24 h后，DU-145早期凋亡率分別為7.49%、10.83%和26.46