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文檔簡介
1、研究背景:
胃癌是最常見的消化道腫瘤,全球每年約有70萬例患者死亡。胃癌的發(fā)病經(jīng)過多個過程,腸上皮化生及不典型增生是胃癌的癌前病變。多種遺傳及表觀遺傳變化參與惡變及癌癥進展過程,但其分子生物學基礎仍不明確。因此,胃癌的診斷、治療及預防需要研究發(fā)現(xiàn)新的分子生物學靶標。
碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA)是由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白,是一種含Zn酶,可參與CO2轉化成H+與HCO3-的可逆反應,從而
2、調節(jié)細胞內外的PH。最初,CAIX被認為是一種腫瘤相關基因,在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用。CAIX在大多數(shù)正常組織中不表達,但在腫瘤組織中高表達,并有著致癌活性。不過,在胃癌組織,CAIX高表達在正常胃粘膜,而在胃癌中被下調。胃癌中CAIX的分子生物學機制可能與其它癌癥不同。關于CAIX在胃癌中的作用仍有爭議,需要充分探討。
目的:
闡明CAIX在胃癌發(fā)病機制中的重要作用,探討相關信號傳導通路及分子生物學機制。
3、 方法:
1.應用reverse transcriptional PCR(RT-PCR)技術檢測22種胃癌細胞中CAIX mRNA的表達情況。7種胃癌細胞中CAIX蛋白質的表達用western blot analysis進行檢測。
2.利用methylation specific PCR(MSP)方法在22種胃癌細胞株、39例癌旁正常胃粘膜、2例腸上皮化生、9例不典型增生及33例胃癌組織中檢測CAIX啟動子的甲基化
4、。
3.為進一步驗證MSP結果,對5種胃癌細胞株、7對正常胃粘膜組織及胃癌組織進行bisulfite genomic sequencing(BGS)檢測。
4.為了研究CAIX的下調與甲基化的相關性,胃癌細胞用5-Aza-2’-Deoxycitidine(5-Aza) and Trichostatin A(TSA)進行處理,再用RT-PCR檢測CAIX的表達重現(xiàn)與否。
5.為檢測CAIX高表達對胃癌細胞生物
5、學行為的影響,建立CAIX高表達穩(wěn)定細胞株(Mock-AGS,CAIX-AGS,Mock-MKN1 and CAIX-MKN1)。為了檢測CAIX高表達對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響,對CAIX高表達穩(wěn)定細胞株進行July stage anaylsis、劃痕試驗和transwell analysis。
6.對CAIX高表達穩(wěn)定細胞株進行xenograft analysis,觀察CAIX高表達對腫瘤發(fā)生的影響。
7.
6、對CAIX高表達穩(wěn)定細胞株及GeneChip Human Gene1.0 ST Array X4進行cDNA microarray analysis,探討相關信號傳導通路。
8.應用免疫組織化學法檢測103例胃癌患者組織中CAIX的蛋白表達情況,結合患者的臨床特征進行分析,探討CAIX在胃癌中的臨床意義。
結果:
1.22種胃癌細胞株中有7種細胞株呈現(xiàn)CAIX mRNA的表達,并且在7種胃癌細胞株中有1種胃
7、癌細胞株呈現(xiàn)CAIX蛋白表達。
2.19(86.4%),2(9.1%)及1(4.5%)種胃癌細胞株分別呈現(xiàn)出CAIX啟動子的full methylation,unmethylation and partial methylation。癌旁正常胃粘膜、腸上皮化生、不典型增生及胃癌組織中也可頻繁觀察到CAIX啟動子的甲基化。
3.BGS結果表明,胃癌組織的甲基化程度與正常組織的相比顯著增高(P<0.001)。
8、4.5-Aza處理胃癌細胞可使CAIX的表達重現(xiàn)。
5.CAIX高表達可下調胃癌細胞遷移及侵襲(P<0.001,P<0.001)。
6.CAIX高表達可抑制腫瘤的形成(P<0.05)。
7.應用cDNA microarray篩選出了77個CAIX高表達相關候選基因組。
8.無淋巴結轉移的胃癌患者與有淋巴結轉移的胃癌患者相比,CAIX的表達在無淋巴結轉移的患者中顯著升高(P<0.05),并且無CAI
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