葛根素對(duì)泡沫細(xì)胞膽固醇攝取及外排功能的影響.pdf

1、【研究背景】冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)是目前危害人類的主要心臟疾病之一。在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是其主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，并且AS斑塊的不穩(wěn)定也是心血管事件發(fā)生的基礎(chǔ)。但對(duì)AS的研究目前仍有許多未知，對(duì)AS的發(fā)病機(jī)理仍未完全明確。
　　在AS斑塊的形成過(guò)程中，目前認(rèn)為脂質(zhì)沉積、氧化修飾和炎癥反應(yīng)是其基本的病理特征，并且血脂代謝異常是AS病程中最重要的危險(xiǎn)因素之一。經(jīng)過(guò)氧化修飾后的低密度脂蛋白(OxLD

2、L)作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的影響，其在病程中可損傷內(nèi)皮功能、促進(jìn)膽固醇的內(nèi)皮下沉積和激活巨噬細(xì)胞遷移與吞噬，進(jìn)而加速AS的演變。泡沫細(xì)胞貫穿著AS病變過(guò)程的始終，尤其是對(duì)斑塊的穩(wěn)定性有著重要影響。巨噬細(xì)胞吞噬了oxLDL后，將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積而形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)脂質(zhì)的代謝紊亂又將導(dǎo)致胞體的漲大、破裂并最終導(dǎo)致AS斑塊的破裂、出血而引發(fā)一系列心血管急癥的

3、發(fā)生。因此，深入研究泡沫細(xì)胞對(duì)膽固醇代謝的機(jī)制將有助于心血管系統(tǒng)疾病的防治。
　　細(xì)胞自噬(Autophagy)在心血管疾病的研究中為近年來(lái)的熱點(diǎn)，細(xì)胞自噬作為機(jī)體的一類細(xì)胞消化異體或過(guò)多的自體蛋白及細(xì)胞器的正常的生理過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中同樣起著舉足輕重的作用，大量證據(jù)表明，在AS斑塊中血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等血管組織主要的細(xì)胞類型均有著自噬現(xiàn)象的改變，而其中，巨噬細(xì)胞占有重要的地位，因此進(jìn)一步探討AS病

4、變過(guò)程中的巨噬細(xì)胞的自噬及其機(jī)制，將為臨床藥物研究以及臨床治療提供新的思路。
　　葛根素（Pur）作為國(guó)藥精華，已發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、保護(hù)缺血心肌和抗心肌缺血再損傷、減少急性心肌梗死面積等多種作用，臨床上主要用于穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死等心血管疾病。目前關(guān)于Pur的研究也表明，其對(duì)AS有著保護(hù)作用。研究表明，Pur處理后動(dòng)物模型中AS斑塊的形成明顯減少，血脂水平較模型組也明顯下降。而在肝細(xì)胞以及心肌細(xì)胞中， Pu

5、r處理可通過(guò)自噬水平的改變而調(diào)控細(xì)胞功能。但目前在泡沫細(xì)胞中，Pur對(duì)巨噬細(xì)胞自噬以及膽固醇代謝的相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步探討。
　　因此，本研究著眼于Pur對(duì)泡沫細(xì)胞自噬現(xiàn)象、胞內(nèi)膽固醇蓄積以及泡沫細(xì)胞膽固醇外排能力的影響及其機(jī)制的探討。
　　【研究目的】在鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中以熒光探針Dil-ox-LDL檢測(cè)細(xì)胞膽固醇攝取能力、熒光膽固醇外排實(shí)驗(yàn)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）等方法，觀察Pur對(duì)oxLDL剌激下巨

6、噬細(xì)胞膽固醇攝取和膽固醇外排功能的影響及其可能的作用機(jī)制，進(jìn)一步完善Pur的藥理機(jī)制并為臨床上葛根素的使用提供依據(jù)。
　　【研究方法】
　　1. RAW264.7細(xì)胞經(jīng)oxLDL誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞泡沫化模型。
　　2.不同濃度Pur處理oxLDL誘導(dǎo)的RAW264.7源性泡沫細(xì)胞。MTS法檢測(cè)不同濃度Pur處理后的細(xì)胞活力。
　　3.以oxLDL誘導(dǎo)RAW264.7源性泡沫細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)處理后，利用dil-ox-LD

7、L檢測(cè)泡沫細(xì)胞膽固醇攝取、NBD標(biāo)記膽固醇外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)泡沫細(xì)胞的膽固醇外排功能以及western blot檢測(cè)LC3II, p62, CD36, ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)、溶酶體酸性脂肪酶（LAL）以及p-AMPK的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1. RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)oxLDL孵育后，油紅O染色證實(shí)細(xì)胞中大量脂質(zhì)小滴形成，表明已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。體外細(xì)胞模型建立成功。
　　2.以不同劑量的Pur處理