人類基因組復雜序列區(qū)域的擴增與測序策略研究.pdf

1、雖然人類基因組計劃已經于2004年宣布完成,但是已完成的人類基因組并不完美,這其中仍然存在著數百個大大小小的測序缺口,并且五年時間已經過去,這些問題依然還未解決。目前人們對這些測序缺口的特征認識還很有限,一般認為,它們通常都具有復雜的序列結構,從而導致對這些區(qū)域所進行的聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)存在擴增效率低、擴增特異性差以及擴增產物難克隆等多重困難。現(xiàn)有的技術還無法解決這些問題,需要依賴于

2、新的研究成果和技術突破。納米粒子PCR作為一項新興的納米生物技術,具有傳統(tǒng)的PCR優(yōu)化方法所不具有的多重優(yōu)化作用,對解決這類問題具有潛在的應用價值。
　　 本文以人類基因組5號染色體上的一個測序缺口作為研究體系,通過結合納米粒子PCR技術、DNA分子的原子力顯微成像技術和巢式PCR、分子克隆等分子生物學方法,對該測序缺口進行擴增、測序及序列分析,并最終獲得了完整的序列。
　　 研究結果表明:
　　 1.由于擴增體

3、系過于復雜的原因,單獨地采用納米粒子PCR并不能起到有效的優(yōu)化作用。但是將納米粒子PCR同巢式PCR相結合,可以改善巢式PCR在擴增復雜序列區(qū)域時仍然存在的擴增效率和擴增特異性的不足。其中擴增特異性的提高還體現(xiàn)在擴增產物用于測序具有更高的測序質量。該特性對于我們獲得該測序缺口的部分序列并作為進行下一步研究的基礎起到了關鍵的作用。
　　 2.該測序缺口中包含了一段特別復雜的區(qū)域,并導致:a.多對引物用于擴增這一區(qū)域都出現(xiàn)了擴增產物

4、長度多態(tài)性;b.擴增產物中的一些片段克隆后的測序結果與克隆前不一致,測序結果長度要明顯短于用于克隆的樣品;c.完整地包含了這一區(qū)域的片段用于克隆效率很低;d.部分擴增產物還易形成十字型二級結構。對最終測序結果的序列分析也證實,該區(qū)域為一段同時富含正向重復和反向重復的序列,并且是這兩類重復序列的共同作用導致了擴增易發(fā)生片段丟失和擴增產物長度多態(tài)性。這些發(fā)現(xiàn)解釋了該測序缺口存在并難以解決的原因,對于我們進一步了解測序缺口的結構特征并發(fā)展更完