家蠶BmNADHb5的表達分析及其亞細胞定位.pdf

1、從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選出一條438 bp的基因序列(基因登錄號:EU826676),編碼150個氨基酸殘基,序列比對發(fā)現(xiàn)是NDUF-b5家族的一個亞基,將該基因命名為BmNADHb5(Bombyx mori Nicotinamide adenine dinucleotide hydridecyto-chrome b5 reductase)。
　　 目的片段經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后插入到高效表達載體pET-

2、28a(+)中,成功構(gòu)建原核表達載體pET-28a(+)-BmNADHb5,在E.coli Rosetta中過度表達重組的pET-28a(+)-BmNADHb5并純化蛋白。超聲破碎表達產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)以包涵體的形式存在于沉淀中,我們通過鎳柱進行純化,以純化的融合蛋白為抗原多次免疫一只雄性新西蘭兔,獲得的抗體用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測得其效價為1:12800以上。我們提取了家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個時期的總蛋白和總RNA,又選擇五

3、齡幼蟲第三天作為實驗對象來研究BmNADHb5的組織分布情況,提取了家蠶的頭、表皮、馬氏管、氣管、脂肪體、絲腺、睪丸和卵巢等組織的總蛋白和總RNA。我們用ELISA半定量法和Western blit以及熒光定量PCR實驗檢測BmNADHb5的表達分析及其分布。ELISA半定量法和Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)BmNADHb5蛋白在家蠶各發(fā)育時期都有表達,其中卵期表達量明顯高于其他發(fā)育時期,在各組織中,氣管、生殖器等表達量較高。熒光