傷寒沙門菌線性質(zhì)粒pBSSB1基因的相關(guān)功能研究.pdf

1、目的：
　　自在原核生物中發(fā)現(xiàn)線性質(zhì)粒以來，對于線性質(zhì)粒的探索一度成為原核生物研究的熱點(diǎn)，其作為獨(dú)立于染色體基因組外的遺傳單位，在細(xì)菌耐藥性及致病方面發(fā)揮了重要作用。質(zhì)粒pBSSB1是目前為止在傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S. Typhi）中發(fā)現(xiàn)的唯一的一種線性質(zhì)粒。本課題組對線性質(zhì)粒pBSSB1其上兩個基因的功能展開研究，進(jìn)一步探索該線性質(zhì)粒在傷寒沙門菌中所發(fā)揮的作用。

2、　　方法：
　　1.傷寒沙門菌LP002、LP008基因高表達(dá)菌株、缺陷株及異源表達(dá)菌株的構(gòu)建。構(gòu)建pBAD-LP008重組載體，鑒定正確后，用陽性重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化傷寒沙門菌野生株（S. Typhi GIFU10007），作為LP008基因高表達(dá)菌株（WT-LP008）和空質(zhì)粒對照株（WT-pBAD）；陽性質(zhì)粒及空載體電轉(zhuǎn)化S. Typhi Ty2感受態(tài)作為LP008基因異源表達(dá)株（Ty2-LP008）及異源表達(dá)對照株（T

3、y2-pBAD）。LP008及LP002基因缺陷株的制備則是將同源重組片段連接于自殺質(zhì)粒pGMB151，將陽性質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入野生株后利用蔗糖平板篩選最終的缺陷菌株（記作△LP002或△LP008）。
　　2. pBSSB1 LP008蛋白的表達(dá)及純化。構(gòu)建pET28b-LP008重組載體并將構(gòu)建成功的陽性載體熱擊轉(zhuǎn)化入E. coli JM109( DE3)感受態(tài)以獲取陽性LP008蛋白表達(dá)株。用IPTG誘導(dǎo)陽性菌株中LP008蛋白

4、的表達(dá)，超聲破菌后取上清采用Ni柱親和層析的方法分離及純化目的蛋白。
　　3.各菌株在不同條件下的生長曲線測定。以生長時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，對比所制備的各菌株和對照株生長情況的差異。
　　4.生物膜合成分析。在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)LP008高表達(dá)菌株及對照株至對數(shù)期，并將菌液接種至96孔板中靜置培養(yǎng)以利于細(xì)菌在固體表面形成生物膜。靜置培養(yǎng)后棄去菌液并用結(jié)晶紫染液對生物膜進(jìn)行染色，經(jīng)蒸餾水漂洗后用冰醋酸

5、溶解孔內(nèi)結(jié)晶紫染料，其吸光度與生物膜的生成量呈正比。
　　5.各菌株的動力實(shí)驗(yàn)。將上述構(gòu)建的各菌株和其對照株培養(yǎng)至對數(shù)期，取野1μl菌液點(diǎn)種于0.3％瓊脂等滲半固體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后測量動力圈直徑，比較細(xì)菌的動力。
　　6.上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將上述構(gòu)建的各菌株和其對照株培養(yǎng)至對數(shù)期后與HeLa細(xì)胞共孵育，比較各個菌株對于HeLa細(xì)胞粘附能力和侵襲能力的差異。
　　7.巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)。將上述構(gòu)建的各菌株

6、和其對照株培養(yǎng)至對數(shù)期后與THP-1細(xì)胞共孵育，比較各個菌株對于巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬水平和細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的存活能力的差異。
　　8.各表型調(diào)節(jié)機(jī)制分析。提取RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR分析諸多表型變化的機(jī)制和其調(diào)控作用的靶基因。
　　9. LP008異源表達(dá)菌株的基因芯片分析。將LP008異源表達(dá)菌株和對照株培養(yǎng)至對數(shù)晚期（OD6000.8），加入阿拉伯糖誘導(dǎo)后提取總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，

7、同時用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的cDNA與基因組芯片探針雜交，經(jīng)掃描后將熒光信號被數(shù)據(jù)化，處理分析數(shù)據(jù)后對比LP008基因高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株的基因表達(dá)譜差異。
　　10.凝膠阻滯試驗(yàn)。將純化的LP008蛋白與靶基因的啟動子區(qū)域序列于室溫共孵育30 min，用6%丙烯酰胺非變性膠電泳檢測LP008蛋白與DNA片段的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建LP008基因高表達(dá)菌株（WT-LP008）、LP008基因異源

8、表達(dá)菌株（Ty2-LP008）、LP002基因缺陷株（△LP002）；LP008基因缺陷株（△LP008）制備失敗。
　　2.成功構(gòu)建LP008蛋白的重組表達(dá)載體，獲取純化的LP008-His6蛋白。
　　3.生長曲線表明，在正常及酸、氧、高滲應(yīng)激條件下，△LP002和野生株并無明顯差異；WT-LP008在正常條件下相比對照株，生長先呈落后趨勢而后反跳。
　　4.生物膜生成分析結(jié)果說明，高表達(dá)LP008基因后傷寒沙門菌

9、的生物膜合成量明顯降低。
　　5.動力實(shí)驗(yàn)表明，△LP002的動力比野生株無明顯變化，而WT-LP008的動力較對照株明顯下降。
　　6.與野生株相比，LP002缺陷株在對數(shù)早期對HeLa細(xì)胞的侵襲力有所增強(qiáng)，而在對數(shù)晚期LP002缺陷株的侵襲力有明顯下降。LP008高表達(dá)株相比對照株，對于HeLa細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。
　　7.與野生株相比，LP002缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力明顯下降。
　　8.通過 qR

10、T-PCR分析，LP008高表達(dá)菌株可以下調(diào)fhlD、fliA、fliL、fljA、fljB、invF、iagA、pilS、csgD的表達(dá)水平從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　9.基因芯片結(jié)果顯示，在S. Typhi Ty2中異源表達(dá)LP008基因后，和對照株相比基因組各基因表達(dá)并沒有明顯變化。
　　10.凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果顯示LP008蛋白可結(jié)合于靶基因啟動子序列，但LP008蛋白對于DNA片段的結(jié)合并沒有特異性。
　　結(jié)論：<