大腸桿菌JM101在氧化應(yīng)激狀態(tài)下代謝流量分配的內(nèi)在機(jī)制.pdf

1、在超氧化物氧化應(yīng)激條件下，細(xì)菌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性的反應(yīng)，我們建立了一個(gè)大腸桿菌的細(xì)胞模型，通過(guò)對(duì)于氧化應(yīng)激現(xiàn)象的研究進(jìn)一步探討了細(xì)胞是如何適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境變化的。超氧化物能促進(jìn)產(chǎn)生對(duì)菌體自體代謝來(lái)說(shuō)過(guò)多的活性氧自由基(ROS)，過(guò)量的活性氧自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝及其它生理活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生不利的影響。為了消除這種不利的影響，細(xì)胞需要以一種適當(dāng)?shù)姆绞絹?lái)調(diào)節(jié)一系列的代謝反應(yīng)，使得細(xì)胞的代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)能在一個(gè)整體的水平上產(chǎn)生相應(yīng)的代謝應(yīng)激。
　　

2、13C標(biāo)記代謝通量分析方法(MFA)經(jīng)常被用來(lái)跟蹤細(xì)菌，酵母，絲狀真菌和動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)的中心碳代謝中的細(xì)胞內(nèi)代謝通量。碳-13標(biāo)記的代謝物可以在整個(gè)代謝系統(tǒng)中被追蹤和監(jiān)控，它們?cè)谀承┐x產(chǎn)物的分配可以由二維核磁共振(2D NMR)或用氣相色譜/質(zhì)譜法(GC-MS)的測(cè)定。依據(jù)這些測(cè)量值，細(xì)胞內(nèi)的碳通量可以通過(guò)參數(shù)擬合程序進(jìn)行估算。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們使用的是13C-通量軟件來(lái)估算最優(yōu)的流量值，流量值的90％的置信度區(qū)間則是用蒙特卡羅抽樣方

3、法計(jì)算的。
　　 在研究中，我們使用MFA的方法用來(lái)研究的是大腸桿菌JM101暴露于百草枯(PQ)時(shí)的氧化應(yīng)激狀況，百草枯(PQ)是氧化應(yīng)激的一個(gè)誘導(dǎo)劑。我們將野生型大腸桿菌JM101細(xì)胞分別在正常培養(yǎng)基和含PQ的培養(yǎng)基中進(jìn)行恒化培養(yǎng)，在進(jìn)行對(duì)兩種狀況下的一些基本生長(zhǎng)參數(shù)和代謝產(chǎn)物的生成參數(shù)比較后，我們用穩(wěn)定狀態(tài)下的13c流量分析方法確定在中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流的分布變化情況。模型中的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、

4、三羧酸循環(huán)、回補(bǔ)反應(yīng)和乙醛酸支路以及ED途徑。
　　 在研究中，我們不僅使用了定量的代謝通量分析方法，而且同時(shí)測(cè)量了代謝中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量和它們的活性，以研究大腸桿菌細(xì)胞為適應(yīng)被超氧化物一百草枯(PQ)所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激現(xiàn)象時(shí)，菌體內(nèi)中心碳代謝所發(fā)生的一系列變化情況，同時(shí)對(duì)所觀察到的整體流量變化相關(guān)的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了深入的探討。
　　 我們的流量分析是基于核磁共振(NMR)及質(zhì)譜(MS)的測(cè)量結(jié)果和計(jì)算機(jī)模擬的定量結(jié)果

5、，從而分析當(dāng)大腸桿菌處于百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下時(shí)碳中心代謝流重新發(fā)生分配的情況的。糖酵解途徑(EMP pathway)的代謝通量被重新導(dǎo)向到磷酸戊糖途徑(PP pathway)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，乙酸量明顯地增加，與此同時(shí)TCA循環(huán)相關(guān)的通量下降，而在乙醛酸支路中的通量又增加。這些整體水平上的通量變化導(dǎo)致了NADPH:NADH的增加和a-酮戊二酸量的積累。
　　 我們?cè)诙苛嗽贓.coli處于PQ氧化應(yīng)激的代謝過(guò)程中代謝碳通

6、量的一系列變化后，發(fā)現(xiàn)這些變化在相當(dāng)大的程度上是存在著相互關(guān)聯(lián)的，并會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生理狀態(tài)的系統(tǒng)性的調(diào)整。一個(gè)主要的適應(yīng)的調(diào)整是NADPH量的增加和NADH量的減少。這反映了細(xì)胞內(nèi)存在一種機(jī)制，這種調(diào)節(jié)機(jī)制使得細(xì)胞能夠在氧化應(yīng)激條件下繼續(xù)生存。我們的研究結(jié)果提供了關(guān)于導(dǎo)致這些系統(tǒng)性變化的代謝通量具體的變化的直接的數(shù)據(jù)。并且表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下代謝通量的整體水平上的重新分配可能是通過(guò)對(duì)關(guān)鍵酶的表達(dá)及活性的調(diào)節(jié)加以實(shí)現(xiàn)的。
　　 而更

7、具有廣泛意義的是，我們的研究提供了一個(gè)實(shí)例，對(duì)關(guān)于大腸桿菌JM101在正常和氧化應(yīng)激兩種狀態(tài)下的代謝通量的分析呈現(xiàn)了關(guān)于細(xì)胞生理狀態(tài)的直接的測(cè)量結(jié)果，而同時(shí)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組的研究則在分子水平上進(jìn)行了研究。在諸如代謝網(wǎng)絡(luò)這樣一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，最終決定不同的生理狀態(tài)的分子水平上的反應(yīng)過(guò)程，是彼此緊密聯(lián)系和相互耦合的，也就是說(shuō)，在細(xì)胞的生理狀態(tài)和分子狀態(tài)的之間的變化有可能存在著并不總是簡(jiǎn)單的，一步一步的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的akd的流

8、量減少是與AKGDH的失活相關(guān)聯(lián)，而和AKGDH表達(dá)量的減少不相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有時(shí)減少的通量伴隨著沒有變化甚至增加了的各自的基因表達(dá)和有關(guān)酶的活性（例如，PGI的步驟和相關(guān)的PGI酶）。這類結(jié)果，突出強(qiáng)調(diào)了不同類型系統(tǒng)水平的研究方法存在著重要的相互補(bǔ)充作用。將這些研究方法結(jié)合在一起，則可以全面和真實(shí)的反映微生物是如何應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激或其他嚴(yán)重的環(huán)境挑戰(zhàn)的。
　　 總的來(lái)說(shuō)，我們關(guān)于大腸桿菌JM101為了適應(yīng)氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)中心碳代謝網(wǎng)