拮抗放線菌W7的篩選、鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、放線菌是具有巨大實用價值的一類微生物,利用其產(chǎn)生抗生素制備的新型農(nóng)藥,具有無污染、無殘留、可再生等特點(diǎn),有效地避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來的諸多環(huán)境問題,是未來開發(fā)農(nóng)藥的方向。但就其數(shù)量、質(zhì)量和品種而言,仍然不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需求,因此尋找新型菌種已成為放線菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。青海生態(tài)條件復(fù)雜而獨(dú)特,決定了放線菌資源的獨(dú)特性,為分離篩選新型菌種提供了可能。本研究從青海高原枸杞根際土壤中進(jìn)行拮抗放線菌的分離、純化,最終獲得一株對多種細(xì)菌具有抑菌活性的

2、放線菌,對其進(jìn)行鑒定,并對其發(fā)酵條件、活性物質(zhì)進(jìn)行初步研究,主要研究結(jié)果如下:
　　1.共獲得90株形態(tài)、顏色各異的菌株,采用瓊脂塊法與杯碟法相結(jié)合進(jìn)行初篩和復(fù)篩,最終獲得一株抑菌活性較好的菌株,將其命名為W7。該菌株對短小芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有抑菌活性,其中對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到20mm以上,對真菌效果不明顯。以青霉素為標(biāo)準(zhǔn)品,通過二劑

3、量法測得該菌株發(fā)酵液的效價為2.452u/ml。
　　2.通過點(diǎn)滴法與葉片夾毒法發(fā)現(xiàn)菌株W7發(fā)酵產(chǎn)物對試蟲具有較好的觸殺活性和胃毒活性,且觸殺活性好于胃毒活性。
　　3.綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析對放線菌W7進(jìn)行分類鑒定,將其初步鑒定為Streptomyces aurantiacus的一個變種。
　　4.通過單因素和正交試驗相結(jié)合對菌株 W7的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:

4、初始pH為8,裝液量為75ml/300ml,發(fā)酵溫度為28℃,接種量為4ml,轉(zhuǎn)速為140-180r/min,發(fā)酵時間為168h。最優(yōu)培養(yǎng)基為玉米粉2％,酵母粉0.6%,磷酸氫二鉀0.075%,氯化鈉0.025%,硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.002%。
　　5.對菌株W7發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。經(jīng)121℃高壓處理20min后,發(fā)酵液的抑菌圈直徑為16.8mm,經(jīng)紫外照射6h后,發(fā)酵液的抑菌圈直徑仍然達(dá)到17mm,在p

5、H4~10的酸堿處理下,發(fā)酵液的抑菌活性無明顯下降,但pH為2時,抑菌圈大小為15.7mm, pH為14時抑菌圈直徑為12.6mm,經(jīng)8周時間的室溫保存,發(fā)酵液的活性沒有出現(xiàn)明顯下降。以上結(jié)果說明發(fā)酵液具有良好的酸堿、紫外照射、儲藏及熱穩(wěn)定性,但在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。
　　6.采用有機(jī)溶劑對發(fā)酵液萃取發(fā)現(xiàn),活性物質(zhì)可以被正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取,且極性越強(qiáng),有機(jī)相分配率越高,而石油醚、苯不能,該物質(zhì)可能是一種中高度極性抗生素;