CyPA-CD147在兔動脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)中的表達研究.pdf

1、目的:
　　1、利用液氮凍傷結(jié)合高脂飲食建立兔動脈粥樣硬化的動物模型，探討兔動脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)情況。
　　2、HE染色、彈力纖維染色及MASSON染色分析兔血管內(nèi)膜及斑塊形態(tài)，測定CD147、CyPA、MMP-9血清學指標變化，免疫組化分析三項指標在血管中表達特點。測定CD147、CyPA在血管中的mRNA表達差異。
　　3、采用病理圖像分析系統(tǒng)分析血管重構(gòu)的相關(guān)指標變化，將血清CD147、CyPA的表達與血管重

2、構(gòu)進行相關(guān)回歸分析。
　　方法:
　　1、構(gòu)建動物模型:按簡單隨機方法將32只健康雄性新西蘭白兔分為對照組、液氮凍傷組、高脂飲食組、模型組，每組8只。對照組持續(xù)普通飲食，不做任何處理;模型組利用液氮凍傷血管內(nèi)膜結(jié)合高脂飲食的方法建立動脈粥樣硬化模型;液氮凍傷組予以液氮凍傷血管內(nèi)膜后持續(xù)普通飲食;高脂飲食組持續(xù)高脂飲食，血管不做任何損傷處理。
　　2、血清學指標測定:分別于實驗開始前、高脂飲食第13周（實驗結(jié)束前），采集

3、各組兔外周血，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組CD147、CyPA、MMP-9等水平。
　　3、病理組織觀察:4組實驗動物于術(shù)后13周處死，每組取造模處或相對應血管的一部分（約4cm），常規(guī)石蠟包埋切片，分別作HE染色、彈力纖維染色、Masson染色，普通光鏡下觀察組織病理學變化，并利用CyPA、CD147、VCAM11單克隆抗體進行免疫組織化學染色。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測血管CD147mRNA和CyPAm

4、RNA的表達差異。
　　4、計算機病理圖像分析系統(tǒng)(Image-proplus6.0)分析血管重構(gòu)參數(shù)血管組織切片進行彈力纖維染色后，采用病理圖像分析系統(tǒng)分析頸動脈外彈力層圍繞面積(EELA)、內(nèi)彈力層圍繞面積(IELA)、管腔面積(LA)、最小管腔直徑(MLD)、最大內(nèi)膜厚度(MIT)、內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)、管腔狹窄度(LS)。
　　5、統(tǒng)計學分析:所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用

5、均數(shù)±標準差的方式表示。多組樣本總體均數(shù)比較采用One-way ANOVA分析。方差齊時多組樣本均數(shù)間的多重比較運用LSD-t檢驗，方差不齊的樣本均數(shù)間的多重比較運用Dunnett'sT3方式檢驗。同組樣本間的前后比較采用配對t檢驗。認為P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、兔總體生長情況
　　兔總體生長良好，模型組的1只新西蘭白兔因麻醉過量死亡，液氮凍傷組的1只死于術(shù)中大出血，其余動物全部完成實驗，所

6、得30只動物數(shù)據(jù)參與分析。
　　2、血清學指標測定
　　血清CD147測定:實驗前，4組兔血清CD147水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在對照組，與實驗前相比，血清CD147水平在第13周無明顯差異（P＞0.05）;在模型組，與實驗前相比，血清CD147水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在液氮凍傷組，與實驗前相比，血清CD147水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在高脂飲食

7、組，與實驗前相比，血清CD147水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4組間第13周血清CD147水平相比，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且在模型組中表達較另外3組明顯升高。血清CyPA測定:實驗前，4組間兔血清CyPA水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在對照組，與實驗前相比，血清CyPA水平在第13周無明顯差異（P＞0.05）;在模型組，與實驗前相比，血清CyPA水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)

8、計學意義(P＜0.05);在液氮凍傷組，與實驗前相比，血清CyPA水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;在高脂飲食組，與實驗前相比，血清CyPA水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);4組間第13周血清CyPA水平相比，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且在模型組中表達較另外3組明顯升高。
　　血清MMP-9測定:實驗前，4組間兔血清MMP-9水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

9、在對照組，與實驗前相比，血清MMP-9水平在第13周無明顯差異（P＞0.05）;在模型組，與實驗前相比，血清MMP-9水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在液氮凍傷組，與實驗前相比，血清MMP-9水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;在高脂飲食組，與實驗前相比，血清MMP-9水平在第13周明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;4組第13周血清MMP-9水平相比，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義

10、(P＜0.05)，且在模型組中表達較另外3組明顯升高。
　　3、免疫組化分析
　　對照組內(nèi)膜光整，可見散在少量巨噬細胞分布，未見CyPA、CD147、MMP-9抗體的表達;中膜可見規(guī)整平滑肌細胞，未見明顯CyPA、CD147、MMP-9及RAM11抗體表達。模型組增生內(nèi)膜及斑塊內(nèi)可見CyPA、CD147、MMP-9呈片狀分布表達，且表達具有同區(qū)域分布的特點。與同一血管同一部位的巨噬細胞抗體染色對比顯示，CyPA、CD147、

11、MMP-9表達多集中于巨噬細胞聚集部位。液氮凍傷組內(nèi)膜輕度增生，中膜光滑規(guī)整，增生內(nèi)膜可見CyPA、CD147、MMP-9的散在表達。同時，可見三者表達區(qū)域相同。高脂飲食組CyPA、CD147、MMP-9在增生內(nèi)膜內(nèi)散在少量表達，內(nèi)膜未增生區(qū)域跟對照組相似，無表達。
　　4、RT-PCR檢測
　　CD147mRNA的表達:在模型組、液氮凍傷組及高脂飲食組較對照組的表達明顯升高。4組間CD147mRNA表達對比有明顯差異，差異

12、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且在模型組中表達較另外3組明顯升高。
　　CyPA mRNA的表達:在模型組、液氮凍傷組及高脂飲食組較對照組的表達明顯升高。4組間CyPA mRNA表達對比有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且在模型組中表達較另外3組明顯升高。
　　5、血管重構(gòu)指標測定
　　模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組較對照組，內(nèi)膜明顯增厚，管腔明顯縮小，中膜面積明顯增厚，管腔狹窄度明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義

13、(P＜0.05）。4組內(nèi)膜面積(IA)相比，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義（F=22.54，P＜0.05），且在模型組中IA較另外3組明顯增厚;4組管腔面積(LA)相比，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.61，P＜0.05），且在模型組中LA較另外3組明顯縮小;4組管腔狹窄度(LS)相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=458.00，P＜0.05)，且在模型組中LS較單純凍傷及高脂飲食明顯增加。結(jié)果表明，動脈粥樣硬化的模型組較液氮凍傷組、高脂飲