HKP-miR-150抗大腸癌微核酸藥物的前期研發(fā).pdf

1、目的：
　　以microRNA-150（miR-150）為活性藥物成分（API），以組氨酸-賴氨酸聚合物（Histidine-Lysine Polymer，HKP）作為體內(nèi)導(dǎo)入載體，研究與開發(fā)微核酸-多肽注射藥物用于大腸癌的特異性靶向治療。
　　方法：
　?。?）配體靶向型載體與微核酸混合試劑的制備
　　采用1％的瓊脂糖作為凝膠電泳支持物，通過瓊脂糖凝膠電泳，定性觀察不同質(zhì)量的HKP對micro RNA的包載能力

2、，初步確定HKP與micro RNA的質(zhì)量比。通過動態(tài)光散射原理，利用激光粒度儀測量不同質(zhì)量比例的HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的粒徑電位，將其作為HKP與micro RNA不同質(zhì)量比的穩(wěn)定性參考。應(yīng)用一種超靈敏的核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的包封率進行測定。使用實時熒光定量 PCR法對導(dǎo)入混合制劑后的 LoVo細胞內(nèi)靶基因mRNA的表達水平進行半定量分析，以檢測HKP-mi

3、R-150混合制劑的體外生物學活性。
　?。?）人大腸癌LoVo細胞系異體移植瘤模型建立及HKP-miR-150混合制劑藥效學驗證
　　4周齡BALB/c裸鼠在無特殊病原菌（Specific pathogens free，SPF）環(huán)境下經(jīng)1周的環(huán)境適應(yīng)期后，取對數(shù)生長期的人大腸癌細胞系LoVo細胞用于皮下移植，每只裸鼠皮下接種5×106個細胞，約7天后成瘤并將裸鼠隨機分成6組。將經(jīng)HKP包載的miR-150及其它控制組的微核

4、酸藥物制劑注射入腫瘤組織，每兩天注射一次藥物，連續(xù)治療9次，整個過程共計18天。隨時觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤大小、形狀及生長狀況。處死裸鼠后分離皮下腫瘤組織，使用熒光定量 PCR檢測腫瘤組織標本中miR-150的表達，增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）法檢測癌細胞增殖情況及原位TUNEL法檢測癌細胞凋亡情況。
　　（3）HKP-miR-150在體內(nèi)代謝分布規(guī)律及HKP安

5、全性評價研究
　　通過cy-3熒光染料對經(jīng)HKP包載的miR-150及未經(jīng)HKP包載的miR-150進行定性對比分析，觀察 HKP-miR-150混合制劑的在動物體內(nèi)代謝以及分布情況。通過在小鼠和食蟹猴兩個動物種屬分別進行急毒和長毒試驗，對豚鼠進行皮膚過敏試驗，評價HPK試劑的安全性。
　　結(jié)果：
　　（1）瓊脂糖凝膠電泳顯示HKP與miRNA質(zhì)量比為4:1時，未能檢測到游離micro RNA，確定HKP（API）與m

6、icro RNA的質(zhì)量比在4:1及以上均可滿足實驗要求。激光粒度儀測量顯示，不同質(zhì)量比例的HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物粒徑電位數(shù)據(jù)均較穩(wěn)定。核酸熒光染料RiboGreen定量試劑對HKP與micro RNA形成納米復(fù)合物的包封率測定結(jié)果顯示：隨著 HKP量的增加，游離 miRNA量在降低，即包封效果在遞增并且4:1的時候，游離miRNA量非常低，適合用于實驗的進一步展開。通過實時熒光定量PCR法檢測HKP-miRNA納米復(fù)合

7、物在體外對細胞靶基因的表達水平，結(jié)果顯示HKP與miRNA質(zhì)量比4:1合適且有效，可以確定作為制劑配方比例。
　?。?）實驗成功建立了裸鼠皮下移植瘤動物模型（36/36）。18天給藥結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)除了 miRNA-150治療組，其它各組都呈現(xiàn)和未治療控制組相似的生長趨勢，而miRNA-150治療組的腫瘤生長顯著減緩。從第七次治療開始，腫瘤生長明顯被抑制；定量RT-PCR檢測腫瘤組織中靶向微核酸表達水平，結(jié)果顯示HKP-miR-150

8、治療組靶向微核酸表達顯著高于其它組別；檢測經(jīng)過治療的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)增殖細胞核抗原在 HKP-miR-150 mimics治療組中，與其它對照組和未治療有顯著差別，經(jīng)過HKP-miR-150 mimics藥物治療的腫瘤組織中的PCNA細胞核大量減少，提示腫瘤細胞死亡；使用經(jīng)典細胞程序化死亡檢測的 TUNEL法，檢測經(jīng)過治療的腫瘤組織，HKP-miR-150 mimics治療組與其它對照組和未治療組有顯著差別，經(jīng)過HKP-miR-150 m

9、imics藥物治療的腫瘤組織中的TUNEL細胞核大量增加，提示治療誘導(dǎo)腫瘤細胞程序化死亡。
　?。?）cy-3熒光定性分析結(jié)果顯示：經(jīng)HKP包載后，miR-150在動物體內(nèi)作用時間較未經(jīng)HKP包載的miR-150在動物體內(nèi)作用時間顯著延長。腹腔臟器成像結(jié)果顯示：HKP-miR-150-Cy-3組小鼠小腸、結(jié)直腸、腎臟、脾臟在24h后仍有藥物富集。安全性評價結(jié)果顯示應(yīng)用HKP包載體的動物均未見明顯全身急性毒性和長期反應(yīng)以及皮膚過敏反

10、應(yīng)，HKP載體安全劑量大于1080μg/kg。
　　結(jié)論：
　　HKP與miRNA按照4:1質(zhì)量比進行混合后，游離miRNA顯著減少，可與HKP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，同時顯著提高了miRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性。動物藥效學實驗顯示該混合制劑通過瘤內(nèi)注射可誘導(dǎo)腫瘤細胞程序化凋亡，有效抑制腫瘤細胞增長。安全性評價研究結(jié)果顯示HKP作為多肽聚合物，具有無毒、生物可降解性強的優(yōu)點，因此，HKP可以作為一種高效低毒的miRNA藥物載體，應(yīng)用于m