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文檔簡介
1、腦外傷(Traumatic brain injury,TBI)是由外力的出現(xiàn)對大腦引起的損傷,在世界范圍內(nèi),腦外傷是致死或致殘的主要病因之一,男性多發(fā)于女性,給社會帶來越來越大的醫(yī)療、護(hù)理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。大腦中調(diào)控情緒和學(xué)習(xí)記憶的重要部位海馬區(qū)位置表淺,有神經(jīng)再生(neurogenesis)在此發(fā)生,容易在腦外傷中受損,其受損后將會帶來一系列長期并且嚴(yán)重的后果。盡管隨著對此疾病的診斷,治療,護(hù)理以及后期康復(fù)訓(xùn)練等水平的提高,現(xiàn)在仍未發(fā)現(xiàn)
2、一種行之有效的治療方法進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生。因此,迫切需要探明腦外傷損傷后病理生理改變機制,從而獲得一種修復(fù)神經(jīng)損傷并改善神經(jīng)功能,促進(jìn)神經(jīng)再生的治療方法。本文擬用人臍帶沃頓膠和(-)-epicatechin從不同途徑治療腦外傷,觀察這兩種治療方式的治療效果。
干細(xì)胞作為新型的一種治療方式,被越來越廣泛的應(yīng)用在腦外傷的治療之中。在眾多不同種類的干細(xì)胞中,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mes
3、enchymal stemcells,hUC-MSCs)具有很強的自我更新和分化能力,來源方便,便于收集,培養(yǎng)和運輸?shù)葍?yōu)點,同時應(yīng)用此細(xì)胞治療避免異種移植時機體的自我排斥的風(fēng)險,沒有道德爭議。已有報道被用來治療腦外傷,取得一定的治療效果。能產(chǎn)生大量hUC-MSCs的臍帶基質(zhì),沃頓膠(Wharton’s Jelly)組織中富含多種膠原成分和透明質(zhì)酸,形成水凝膠結(jié)構(gòu),能夠承受擠壓、拉伸等外力,同時微環(huán)境結(jié)構(gòu)具有支持細(xì)胞生長和充當(dāng)組織支架,目
4、前尚無有關(guān)于應(yīng)用臍帶沃頓膠治療腦外傷的相關(guān)報道。因此,我們選擇WJ組織治療TBI,觀察損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),取得很好的治療效果。
(-)-Epicatechin(EC)--黃烷醇(Flavanols)的一種,廣泛存在于可可、紅酒、茶、水果和蔬菜中,可激活體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)通路,從而改善機體氧化防御系統(tǒng)。EC被認(rèn)為是通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(Nuclear factor erythroid2-related factor2 Nrf
5、2)信號通路發(fā)揮功能。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE),調(diào)控下游的抗氧化蛋白、蛋白酶體、II相解毒酶和分子伴侶等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在小鼠腦出血模型中,EC激活Nrf2/ARE通路,起神經(jīng)保護(hù)作用。在此實驗中,運用EC治療小鼠控制性皮層撞擊腦外傷模型(Controlled cortical impact,CCI),發(fā)現(xiàn)EC可
6、明顯改善小鼠神經(jīng)功能恢復(fù),有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用。
第一部分人臍帶沃頓膠(Wharton’s Jelly)在腦外傷神經(jīng)修復(fù)作用中的實驗研究
目的:
建立改良自由落體腦外傷動物模型,探索人臍帶沃頓膠移植是否促進(jìn)大鼠腦外傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。
方法:
應(yīng)用SD大鼠,建立改良自由落體腦外傷動物模型。隨機分為 Sham組,TBI+Vehicle組和TBI+WJ tissu組。腦外傷24小時后,進(jìn)
7、行WJ組織移植。觀察腦外傷后1天至28天大鼠體重變化,mNSS評分變化。同時觀察大鼠腦外傷后3天腦水含量的改變,28天時大腦損傷體和損傷周圍神經(jīng)元的存活情況,以及腦外傷后第14天不同組間BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)和TBI后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能(新物體識別實驗和Morris水迷宮實驗)的改變。
結(jié)果:
1. hUC-MSCs的鑒定流式細(xì)胞儀檢測第3代的hUC-MSCs,結(jié)果顯示:CD29和CD44呈高表達(dá),CD34,CD
8、133,HLA-DR(MHCII)和CD45均呈陰性表達(dá)。
2.動物模型成功構(gòu)建本實驗中,共使用98只大鼠,死亡2只。其中TBI+Veh組死亡1只,該組死亡率3.33%(1/33);TBI+WJ tissue組死亡1只,該組死亡率3.33%(1/33)。
3. WJ組織治療TBI減少腦損傷體積TBI后28天,HE染色,Sham組未見明顯損傷,TBI+Veh組損傷體積為16.00±1.14mm3,高于TBI+WJ ti
9、ssue組的12.10±1.28mm3,兩組相比,p<0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。
4. WJ組織治療TBI增加大鼠術(shù)后體重TBI后,大鼠體重在1天,3天減輕,從7天開始體重增加。TBI+Veh組和TBI+WJ tissue組1天,3天,7天,14天和21天各組體重?zé)o明顯變化。28天時,TBI+WJ tissue組大鼠重量重于TBI+Vehicle治療組(p<0.05)。
5. WJ組織治療TBI減輕大腦水含量腦外傷可以
10、顯著增加大腦水含量,3天后,經(jīng)WJ tissue治療,和Vehicle治療組相比,大鼠大腦水含量減少(p<0.05)。
6 WJ組織治療TBI改善大鼠運動功能腦外傷21天和28天后,TBI+WJ tissue組mNSS評分低于TBI+Veh組(p<0.05)。
7 WJ組織治療TBI改善大鼠認(rèn)知功能腦外傷28天,在新物體識別實驗中,Sham組的大鼠探索新物體時間明顯多于舊物體。而在TBI+Veh組中,大鼠探索新、舊物
11、體所用時間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。經(jīng) WJ組織治療后,大鼠探索新物體時間多于探索舊物體所用時間(p<0.05)。相對于TBI+Veh組中的新物體的辨別指數(shù),TBI+WJ tissue組辨別指數(shù)中明顯增高(p<0.05)。在水迷宮實驗中,TBI后26天到28天,TBI+Veh組中的大鼠在正確象限時間明顯少于Sham組大鼠(p<0.05)。TBI后27天,28天,TBI+WJ tissue組中大鼠在正確象限時間,明顯高于TBI+V
12、eh組(p<0.05)。在TBI后第24天到28天,大鼠找到平臺所用時間在TBI+Veh組明顯多于Sham組(p<0.05)。經(jīng)WJ組織治療后,大鼠在TBI后27天和28天中找到平臺所需時間明顯少于TBI+Veh組(p<0.05)。
8. WJ組織治療TBI增加BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)腦外傷后14天,BDNF蛋白和mRNA的表達(dá)在 TBI+Veh組中有增高的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。經(jīng)WJ組織治療后,和TBI+
13、Veh組相比,BDNF蛋白和mRNA表達(dá)量明顯增高(p<0.05)。
9. WJ組織治療TBI增加損傷附近MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)腦外傷后28天,在損傷區(qū)域附近,經(jīng) WJ組織治療后,MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于 TBI+Veh組(p<0.05)。
第二部分(-)-Epicatechin在腦外傷中神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用的實驗研究
目的:
研究腦外傷后,(-)-epicatechin(EC)是否通過激活N
14、rf2/ARE通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能,是否能促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)再生。
方法:
使用控制性皮層撞擊模型(Cortical impact model,CCI)模擬腦外傷的發(fā)生。在腦外傷后3h,開始口服EC,每天一次,短期觀察給予3次EC,長期觀察給予7次EC。我們通過大腦損傷體積,腦水腫,白質(zhì)損傷,活性氧(reactive oxygen species,ROS)表達(dá),運動功能評,認(rèn)識能力和情緒障礙,以及 Nrf2相關(guān)蛋白表達(dá)等
15、方面評價 EC的神經(jīng)保護(hù)功能。Nrf2基因敲除小鼠被用來判定腦外傷后EC是否通過Nrf2/ARE通路起神經(jīng)保護(hù)作用。用EdU顯色,評價海馬區(qū)神經(jīng)再生情況。
結(jié)果:
1. EC治療腦外傷改善小鼠短期運動功能同時減少大腦損傷體積腦外傷3天后,EC15mg/kg組降低腦損傷體積。同時改善從第1天到第3天的小鼠的運動功能(p<0.05)。其他劑量未能有如此效果,所以選擇此劑量為治療劑量。
2. EC長期治療腦外傷減
16、少大腦損傷體積,神經(jīng)元變性壞死,改善神經(jīng)功能恢復(fù)腦外傷后連續(xù)7天給予小鼠EC(15mg/kg),28天后,EC減少腦外傷后大腦的損傷體積。同樣,和Vehicle組對比,EC長期治療后,改善腦外傷后1天,3天,7天,14天,21天和28天小鼠運動功能和認(rèn)知功能(神經(jīng)功能缺損評分,前肢放置實驗,掛線實驗、轉(zhuǎn)棒實驗、新物體識別實驗)。EC治療可增加小鼠的糖水偏嗜度并減少小鼠懸浮時間和不動時間,減輕抑郁癥狀(強迫游泳和懸尾實驗)。腦外傷3天后,
17、PI染色顯示,大腦損傷周圍區(qū)域壞死細(xì)胞由Vehicle組的164.58±9.64減少至EC治療組的118.56±7.16(p<0.05)。FJB染色陽性細(xì)胞代表神經(jīng)元變性壞死,相對于Vehicle組,在損傷區(qū)周圍,EC治療組有更少的FJB染色陽性細(xì)胞數(shù)(p<0.05)。腦外傷后28天,經(jīng)EC治療后,EC明顯增多大腦左側(cè)上半部皮層腦外傷后神經(jīng)元存活個數(shù)(p<0.05),具有神經(jīng)保護(hù)功能。此外,腦外傷后3天,經(jīng)EC治療,損傷側(cè)半球腦水含量由
18、79.87±0.40%(Vehicle組)降為78.86±0.17%(p<0.05)。
3 EC治療腦外傷減輕腦外傷后白質(zhì)損傷我們用Luxol fast blue染色和MBP染色標(biāo)記大腦白質(zhì)中正常髓鞘。腦外傷28天后,EC治療組Luxol fast blue和MBP染色陽性區(qū)域面積占總面積百分比明顯高于Vehicle組(p<0.05)。
4 EC治療腦外傷后減少ROS產(chǎn)生同時減輕MMP-9活性HEt染色被用來檢測RO
19、S的產(chǎn)生。腦外傷后3天,處死腹腔注射HEt的小鼠,統(tǒng)計分析熒光強度,結(jié)果顯示,EC治療腦外傷后ROS產(chǎn)生量明顯低于Vehicle組(p<0.05)。經(jīng)EC治療后,腦外傷3天后,MMP-9活性相對于Vehicle組降低51%(p<0.05)。
5 EC治療腦外傷后減少蛋白Keap-1表達(dá)同時增加細(xì)胞核內(nèi)蛋白Nrf2表達(dá)腦外傷3天后,經(jīng)EC治療后,和Vehicle組相比,EC進(jìn)一步降低Keap-1蛋白的表達(dá)量(p<0.05)。在胞
20、質(zhì)中,EC治療腦外傷后,胞質(zhì)Nrf2蛋白未見明顯增多(p>0.05),但相對于Vehicle治療組,腦外傷3天后,EC增加Nrf2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(p<0.05)。
6. EC治療腦外傷增加SOD1和NQO1蛋白表達(dá),降低HO-1蛋白表達(dá)和鐵沉積,未減少大腦血紅蛋白含量。腦外傷3天后,EC治療組的SOD1和NQO1表達(dá)量進(jìn)一步增加,明顯高于Vehicle組(p<0.05)。相反的是,雖然腦外傷后,Vehicle組HO-1蛋白
21、的表達(dá)量明顯增高于Sham組經(jīng)EC治療,EC治療組HO-1表達(dá)量低于Vehicle治療組(p<0.05)。腦外傷3天后,檢測腦組織血紅蛋白含量,發(fā)現(xiàn)在EC治療組和Vehicle治療組的腦中血紅蛋白含量無明顯差異(p>0.05)。檢測腦外傷后3天,腦損傷附近鐵沉積情況,結(jié)果顯示,對比于Vehicle治療組,EC顯著減少損傷周圍鐵沉積(p<0.05)。
7. EC治療腦外傷促進(jìn)海馬SGZ區(qū)神經(jīng)再生腦外傷后3天,EC治療組EdU陽性
22、細(xì)胞數(shù)和Ki67陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于Vehicle治療組(p<0.05)。
8. EC治療Nrf2基因敲出小鼠腦外傷未明顯減少腦損傷體積和未明顯改善神經(jīng)功能恢復(fù)為驗證EC是否在腦外傷后通過Nrf2通路起神經(jīng)保護(hù)作用,我們建立Nrf2基因敲出小鼠CCI模型,觀察EC治療效果。腦外傷28天后,Vehicle治療組的Nrf2基因敲出小鼠和EC治療組的大腦損傷體積無明顯差異(p>0.05)。神經(jīng)功能缺損評分實驗中,腦外傷后3天,7天,1
23、4天和28天,經(jīng)EC治療的Nrf2基因敲出小鼠評分低于Vehicle治療組(p<0.05)。Nrf2基因敲出小鼠腦外傷后,在前肢放置實驗和掛線實驗中,在EC治療組和Vehicle治療組的小鼠未見明顯差異(p>0.05)。在轉(zhuǎn)棒實驗中,EC治療組的Nrf2基因敲出小鼠的墜落時間在第3天長于Vehicle治療組(p<0.05),但是在其它時間點,兩組之間未見明顯差異(p>0.05)。腦外傷28天,Nrf2基因敲出小鼠在新物體識別實驗和糖水偏
24、嗜實驗中,EC治療組和Vehicle治療組實驗結(jié)果未見明顯差異(p>0.05)。此外,在懸尾實驗和強迫游泳實驗中,腦外傷后,腦外傷增加小鼠的不動時間和懸浮時間(Vehicle組VS Sham組,p>0.05),而經(jīng)EC治療后,Nrf2基因敲出小鼠的不動時間和懸浮時間在EC治療組和Vehicle治療組未見明顯差異(p>0.05)。
結(jié)論:
腦外傷后,用臍帶沃頓膠治療,可以改善運動功能和認(rèn)知功能,同時促進(jìn)BDNF表達(dá),保
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