脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PGA-PLA支架構(gòu)建微血管化工程組織的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、組織移植是整形外科修復(fù)組織缺損的常用治療手段。近年來,飛速發(fā)展的組織工程技術(shù)給組織修復(fù)帶來了新的希望。組織工程化組織移植與自體組織移植類似,植入體內(nèi)后同樣存在一個血運重建的過程。然而,組織工程移植物血管化的速度通常非常緩慢,血管化不良已經(jīng)成為組織工程發(fā)展的限制因素。研究表明,三維支架的使用有利于細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)和構(gòu)建復(fù)合組織。人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)可以沿

2、著心血管方向分化且具有促血管形成特性。聚羥基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)因其優(yōu)越的性能在骨、軟骨、肌腱等組織工程領(lǐng)域應(yīng)用已久。hADSCs接種在聚乳酸(Polylactic acid,PLA)塑形后的PGA三維支架上是否有利于構(gòu)建微血管化的工程組織尚未見報道。我們的研究可能為提高工程組織血管化效率,促進(jìn)皮膚缺損和慢性創(chuàng)面的愈合帶來新的契機(jī)。
  目的:
  1.評價hADSCs接種在PGA/PLA復(fù)合支

3、架后定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能,探索將hADSCs-PGA/PLA復(fù)合物構(gòu)建為微血管化的組織工程產(chǎn)物的可行性。
  2.探索hADSCs-PGA/PLA復(fù)合物的生物相容性。
  3.觀察誘導(dǎo)后的hADSCs-PGA/PLA復(fù)合物對裸鼠皮膚缺損愈合情況的影響,為提高血管化效率以促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供實驗依據(jù)。
  方法和結(jié)果:
  1.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA支架后分化為內(nèi)皮細(xì)胞能力的研究
  方法:

4、取新鮮游離脂肪顆粒,采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法對hADSCs進(jìn)行分離和純化。將hADSCs接種于PGA/PLA支架材料后,使用額外添加20ng/mL血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的成血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),通過掃描電鏡觀察hADSCs在PGA/PLA支架材料上的貼附、生長與增殖情況。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞活性以及攝取乙?;兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素

5、的能力,并于培養(yǎng)第7、14、21d進(jìn)行免疫熒光染色觀察細(xì)胞對CD31、vWF、VEGFR2、α-SMA的表達(dá),同時提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行Real-time PCR檢測VEGF、vWF、eNOS、α-SMA基因表達(dá),綜合評價hADSCs在PGA/PLA支架材料上定向誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛能。
  結(jié)果:hADSCs可以在PGA/PLA支架上良好地貼附、生長和增殖,并在誘導(dǎo)培養(yǎng)21d時獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性抗原標(biāo)記,同時具有攝取乙?;?/p>

6、密度脂蛋白和結(jié)合荊豆凝集素的能力,并且CD31、VEGFR2、vWF、eNOS基因表達(dá)在14d和21d均高于未誘導(dǎo)或者二維誘導(dǎo)的hADSCs(p<0.05),而α-SMA的表達(dá)在細(xì)胞水平和mRNA水平均較低(p<0.05)。
  2.誘導(dǎo)后的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-PGA/PLA復(fù)合物的體外免疫抑制作用
  方法:分離人外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),將成內(nèi)皮細(xì)

7、胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的hADSCs-PGA/PLA(hADSCs-PGA/PLA誘導(dǎo)組)與PBMC體外共培養(yǎng),3d后CFSE法觀察PBMC的增殖情況,ELISA法檢測炎性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平,采用Transwell小室同時檢測hADSCs-PGA/PLA誘導(dǎo)組與PBMC直接接觸和間接接觸時免疫抑制情況的差異。
  結(jié)果:PHA能刺激PBMC的增殖和對炎性因子的分泌。hADSCs-PGA/PLA誘導(dǎo)組與PBMC共培養(yǎng)不能刺激

8、PBMC增殖,也不能使IFN-γ和IL-2分泌增加。相反,hADSCs-PGA/PLA誘導(dǎo)組能夠顯著抑制與PHA共培養(yǎng)的PBMC的增殖以及對IFN-γ和IL-2的分泌(p<0.05)。且細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸組抑制PBMC分泌IFN-γ和IL-2的能力大于間接接觸組(p<0.05)。
  3.誘導(dǎo)后的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-PGA/PLA復(fù)合物修復(fù)皮膚缺損能力的研究
  方法:以BALB/c裸鼠為實驗動物構(gòu)建皮膚缺損模型,以覆蓋成內(nèi)

9、皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的hADSCs-PGA/PLA和組織工程皮膚為治療手段,選取7d、14d、21d三個時間點觀察皮膚缺損愈合情況,同時進(jìn)行透光實驗、HE染色等判斷血管新生情況,采用天狼星紅染色、Masson染色觀察新生皮膚組織膠原纖維的類型以及沉積和排列。為進(jìn)一步探索誘導(dǎo)后hADSCs在新生血管形成中的作用和角色,我們采用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)慢病毒轉(zhuǎn)染的hADSCs接種部分PGA/PLA

10、支架,植入體內(nèi)21d取材切片CD31免疫熒光染色后進(jìn)行示蹤。
  結(jié)果:誘導(dǎo)后的hADSCs-PGA/PLA能顯著加快皮膚創(chuàng)面修復(fù)速度,新生組織具有更豐富的血管,且膠原纖維的沉積和排列與正常皮膚組織無明顯差異。同時,免疫熒光染色顯示,支架上的hADSCs直接參與新生血管的組成。
  結(jié)論:
  1.PGA/PLA復(fù)合支架是一種生物相容性良好的可降解材料,hADSCs在PGA/PLA支架上可以良好的貼附、生長和增殖,在成

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